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将嗜热菌Geobacillus Kaustophilus HTA426中的磷酸三酯酶基因转入毕赤酵母GS115中,整合到染色体DNA基因组上,并进行诱导表达.SDS-PAGE和Western-blot试验结果显示,重组蛋白是一个分子量约为50KD的磷酸三酯酶二聚体.酶活检测证明重组蛋白具有较高的磷酸三酯酶活性,其最适温度为70℃,最适pH为10.0. 相似文献
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高丝氨酸脱氢酶(HSD)是天冬氨酸族氨基酸合成途径的关键酶,在苏氨酸和蛋氨酸生物合成中起到重要作用。将来自于北京棒杆菌AS1.299的HSD在E. coli BL21(DE3)中成功构建并进行高效异源表达。通过分子对接与同源序列比对发现,206位点参与底物结合,并且在家族中高度保守,因此对突变体D206G进行研究。结果表明:突变体最适pH7.5,最适反应温度37℃,半衰期为4h,并对金属离子和有机溶剂显示出良好的抗性。同野生型相比,突变体Km值减小,可能是由于侧链官能团减小,空间位阻降低,有利于底物结合。 相似文献
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通过对玉米半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease from Zea mays,zmCP1)同源模建和底物对接研究发现,W308位点在木瓜蛋白酶家族(C1家族)高度保守,且位于zmCP1催化三联体残基N306位点附近,与绝大多数底物形成π-π键,可参与底物和酶活性中心的结合,是该酶的关键位点;结合Rosetta design程序设计,对W308位点进行突变,获得W308C突变体,并在大肠杆菌BL21中表达。酶学性质表征实验结果表明:突变体W308C的最适温度为55 ℃,最适pH 6.0;在70、80、90 ℃下的半衰期为75.33、57.24、40.29 min,分别是野生型的1.21、1.19、1.01倍;突变体W308C和野生型的特异性常数Kcat/Km分别为11.02、5.92 L/(μmol·min),催化活性提高了0.86倍。 相似文献
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通过序列比对和晶体结构分析发现,天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)的G277位点高度保守,并与抑制剂Thr通过氢键相连,对其进行定点突变和酶学性质表征。结果表明:突变体G277K的AK最适反应条件是30 ℃、pH 8.5;动力学实验结果显示突变体AK的正协同效应降低,趋向于米氏酶,参数S0.5、nH、酶比活力、Vmax分别是7.05 mmol/L,1.24、964.3 U/mg、32.143 U/(mg·min);热稳定性实验显示,其30 ℃半衰期为2.3 h,3 h后酶活力丧失80%左右;Ni2+在低浓度时表现出显著的激活效应;有机溶剂丙三醇、异丙醇和二甲基亚砜的体积分数为1%时,对AK的酶活力有很好的激活作用,表明突变体AK对一些有机溶剂有一定的抗性;低浓度的赖氨酸和蛋氨酸对AK有激活作用。 相似文献
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