大肠杆菌FMME-N-26生产琥珀酸的发酵条件优化和放大

琥珀酸(Succinic acid)被认为是白色生物技术生产的最具潜力的大宗化学品之一,在工业上具有广泛的应用。微生物发酵生产琥珀酸具有环境友好和可持续发展等优点,展现出良好的发展前景,但是存在得率低、副产物积累、生产强度低等问题。为了实现琥珀酸的高效生产,在3.6 L发酵罐中对E. coli FMME-N-26生产琥珀酸发酵条件和补料策略进行了优化,建立了好氧-厌氧两阶段发酵工艺,最终确定发酵策略为：有氧发酵8 h后转为厌氧发酵,MgCO3为pH中和剂,发酵72 h补加抗渗透压保护剂2 mmol/L甜菜碱,厌氧阶段控制葡萄糖浓度为1~5 g/L。优化后发酵72 h,琥珀酸的产量和厌氧阶段得率分别达到119.2 g/L和1.08 g/g葡萄糖(理论得率97%),分别比优化前提高了46.4%和4.8%,副产物乙酸和乳酸仅积累2.37和0.94 g/L,分别比优化前降低了37.1%和49.2%。在1000 L发酵罐中实现中试放大生产,E. coli FMME-N-26生产琥珀酸的产量、得率和生产强度在国内外属于领先水平,为琥珀酸工业化生产奠定了坚实的基础,同时也为其他高价值化学品的生产提供了借鉴。     

代谢工程改造大肠杆菌生产琥珀酸

琥珀酸（succinic acid）是一种四碳二羧酸,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,微生物法生产琥珀酸存在得率低、生产强度低、副产物积累等问题。为此,本研究通过复合诱变（ARTP和⁶⁰Co-γ射线）筛选到一株耐高渗突变株FMME-N-2,其琥珀酸得率为0.70g/g葡萄糖,同时积累18.8g/L乳酸、7.6g/L甲酸和17.3g/L乙酸。为了提高琥珀酸得率,通过敲除乳酸脱氢酶基因（ldhA）、丙酮酸-甲酸裂解酶-甲酸转运蛋白基因（pflB-focA）、磷酸转乙酰基基因（pta）、丙酸激酶基因（tdcD）和a-酮丁酸甲酸酯裂解酶基因（tdcE）,阻断冗余代谢支路减少副产物积累,获得工程菌株FMME-N-13,琥珀酸得率增加到0.92g/g葡萄糖,同时副产物大大降低,积累0.6g/L乳酸、3.6g/L甲酸和12.3g/L乙酸。同时,通过调控RBS强度组合优化来自产琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（AsPCK）和来自博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因（CbFDH）的表达水平,调控胞内ATP和NADH的浓度,最优工程菌FMME-N-26（FMME-N-13-L-AsPCK-L-CbFDH）的琥珀酸得率增加至1.04g/g葡萄糖,仅积累5.5g/L乙酸;最终,对厌氧阶段葡萄糖浓度进行优化,当葡萄糖浓度控制在0~5g/L时,菌株FMME-N-26的琥珀酸浓度增加到111.9g/L,得率为1.11g/g葡萄糖（理论产率的99%）,生产强度为1.76g/L/h,为琥珀酸的工业化生产奠定了良好的基础。     

代谢工程改造大肠杆菌利用脂肪酸合成己二酸

己二酸作为生产尼龙、化纤和工程塑料等聚合物的单体,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,己二酸的生物合成主要利用可食用原料,碳原子损失较多,造成己二酸产率较低。为解决上述问题,设计和重构以脂肪酸为原料的己二酸合成新路径,提高己二酸的理论得率;其次,强化本源的β-氧化路径和引入异源的ω-氧化路径;增强细胞对脂肪酸的利用能力;再次,借助系统代谢工程策略,进一步优化己二酸合成路径。最后,经发酵条件优化,最优工程菌Escherichia coli AA0304能够产生1.32 g/L己二酸。上述研究结果为利用废弃脂肪酸类化合物生产高价值化学品奠定了良好的基础。     

代谢工程改造微生物合成生物基单体的进展与挑战

单体是合成聚合物所用的小分子基础原料,目前主要来源于化石燃料。利用微生物制备生物基单体具有生产条件温和、环境友好、可持续的优势,是实现高分子材料行业绿色制造的重要途径。借助代谢工程和合成生物学元件,目前已经实现了多种单体的微生物制造,然而与石油基生产工艺相比,这些单体微生物细胞工厂的生产性能普遍较低。围绕代谢工程改造微生物合成生物基单体过程中存在的瓶颈问题,本文基于具体案例分析,从廉价底物的高效利用、提高生物基单体合成效率、强化细胞环境耐受性三个方面,总结了改造微生物合成单体的最新研究进展。同时,讨论了单体微生物细胞工厂目前存在的挑战和未来发展方向。     

微生物细胞工厂碳流调控进展

随着代谢工程技术的进步,越来越多微生物细胞工厂可用于化学品发酵生产。微生物细胞生产化学品具有生产条件温和、环境友好等优势,是实现化学品绿色可持续生产的重要手段。为了提高微生物细胞工厂的产量、得率和生产强度,传统代谢工程手段主要采用基因过表达或基因敲除方式增大目标代谢路径碳代谢流。然而由于代谢流调控精度不足,易导致细胞生产能力下降。本文主要针对微生物细胞工厂碳流调控中存在的瓶颈问题,从代谢流改造靶点选择、细胞生长与产物合成碳流平衡、副产物路径与产物合成竞争、产物合成效率强化四个角度,系统综述微生物细胞工厂碳代谢流调控的最新进展。并从高精度、仿生学、智能化、多任务、快响应调控工具的设计出发,对未来微生物细胞工厂的发展趋势进行展望。     

人工代谢路径适配性的研究进展

微生物细胞工厂以可再生资源为原料,实现了大宗化学品和天然产物的可持续生产,并有望替代石油化工炼制和动植物提取。剪接天然或人工代谢路径是构建微生物细胞工厂的基础。然而,剪接代谢路径造成的代谢流扰动,导致微生物细胞工厂的适配性差,降低了微生物细胞工厂的生产性能。提高人工代谢路径之间的适配性,以及人工代谢路径与底盘微生物细胞之间的适配性,将是改善微生物细胞工厂生产性能的关键。本文从强化与平衡人工代谢路径的代谢通量,解除人工代谢路径与底盘细胞内源代谢路径的交互作用,以及强化人工代谢路径与底盘细胞整体代谢网络的适配性层面,对提高微生物细胞工厂适配性的研究现状进行介绍。开发高效的多重适配性调控策略,在细胞水平重置代谢路径的适配性与提高微生物细胞对代谢产物的适配性,将是未来的研究重点。     

基于2-酮基-D-葡萄糖酸高产的发酵条件优化研究

为了实现异维生素C前体2-酮基-D-葡萄糖酸在沙雷氏菌Serratia sp. FMME043中的高效生产,在30 L发酵罐中对补料策略和发酵条件进行了优化,建立了补料分批发酵工艺。最终确定发酵策略为:溶氧控制在40%,在发酵16、22 h及28 h时分别补加64、80 g和96 g硫酸铵,并且当残糖浓度降至15～25 g/L时,分五次等量补加801 g葡萄糖,优化后,发酵44 h,2-KGA的产量和转化率分别达到268.5 g/L和1.04 g/g,分别比优化前提高了58.4%和9.9%。本研究结果为目前报道的产量和转化率在国内外属领先水平,为2-酮基-D-葡萄糖酸及异维生素C工业化生产打下了坚实的基础。     

多酶级联催化合成（R）-β-酪氨酸

目前报道的β-酪氨酸生产方法需要较为复杂的底物而且大多依赖于贵金属催化剂。为了实现生物法绿色合成β-酪氨酸,通过人工设计的级联反应,将酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸氨基变位酶进行级联,以苯酚、丙酮酸和铵盐等廉价化合物为底物合成(R)-β-酪氨酸。通过基因挖掘筛选了所需的酶元件,并采用蛋白质工程改造,提升了限速酶的催化效率。在大肠杆菌宿主中对所筛选的酶进行共同表达,经优化获得了(R)-β-酪氨酸合成菌株E. coli S10。在1 L规模反应中,菌株E. coli S10合成(R)-β-酪氨酸的转化率达到78%,ee值>99%。利用高分辨质谱(HRMS)和核磁共振图谱(NMR)分别鉴定了纯化产物的分子量和结构,结果表明通过该级联路径可成功合成目标产物(R)-β-酪氨酸。研究工作可为(R)-β-酪氨酸的绿色酶法生产提供理论指导。     

强化前体（UDP-GalNAc）合成路径提高果糖软骨素的生产

硫酸软骨素是一种重要的糖胺聚糖,广泛应用于医药、食品、保健品行业。为了提高硫酸软骨素类似物果糖软骨素的生产,通过过量表达磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)、葡萄糖胺合酶(GlmS),优化融合蛋白glmM-glmS的表达水平,获得了最优工程菌株E. coli K4-H-glmMglmS,并确定了最适IPTG浓度(0.4 mmol/L)以及诱导温度(37℃)。最后,在5-L罐水平下,借助DO-stat补料模式,果糖软骨素的产量达到了3.99 g/L,较原始菌株提高了108.9%,为工业化生产果糖软骨素奠定了基础。     

ARTP选育ε-聚赖氨酸高产菌株及其发酵条件优化

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由25~35个L-赖氨酸单体组成的一种天然聚合物,在食品、医学、农药等领域有很大的应用潜力。目前,微生物法生产ε-PL存在生产强度低、发酵周期长、工艺不稳定等问题。为此,本研究以S.albulus FMME-545为出发菌株,通过常温常压等离子诱变(ARTP)结合核糖体工程选育了一株具有利福霉素抗性的高产菌株S.albulus FMME-545RX,其ε-PL产量达到2.44 g/L,相较于出发菌株提升了105%。为了进一步提高ε-聚赖氨酸的产量,在5 L发酵罐中通过分批补料的方式对碳源的调控策略、pH调控方法、DO控制水平进行了系统的研究。结果表明,采用葡萄糖-蔗糖双碳源调控策略有助于提高菌体代谢强度;在发酵过程中添加柠檬酸钠能有效帮助菌体抵御酸性环境;产物合成所需的最适pH值和DO值分别为3.80和30%。经过192 h的分批补料发酵,ε-PL的产量、生产强度、单位细胞合成能力分别达到了53.0 g/L, 6.63 g/(L?d), 0.88 g/g,相比于原始菌株分别提高了130%, 131%, 118%。上述研究结果为ε-聚赖氨酸工业化生产提供了有益的借鉴。