单核增生性李斯特菌hly缺失菌株的构建及生物特性的初步鉴定

为研究单核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)hly基因对毒力的影响,利用同源重组原理,使用穿梭载体,构建单核细胞增生性李斯特菌野生菌株EGD-e的hly基因缺失菌株EGD-eΔhly。细菌活性实验证明缺失菌株生长状态与亲本无差异,但EGD-eΔhly丧失溶血活性,细胞侵袭能力降低约90%,在10~7 cells/m L腹腔注射条件下不表现动物毒性。在转录水平上EGD-eΔhly的毒力基因inl C、prf A的表达量分别下降了81%和76%,act A、plc B的表达量分别提高了2.7倍和1.8倍。hly缺失菌株的成功构建及生物特性的初步研究结果为研究Lm致病机理提供依据。     

inlA和inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌侵袭HT29结肠癌细胞的影响

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是人畜共患的食源性致病菌,其可以穿透多个宿主屏障,而内化素蛋白家族被认为是LM穿透宿主屏障过程中起重要作用的毒力因子。本研究利用同源重组的方法构建了LM野生菌株EGDe的inlA和inlB基因双缺失菌株,利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测其主要毒力基因表达的变化,并以HT29结肠癌细胞为对象,研究inlA和inlB基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明基因的缺失对其生长能力没有影响,但多个毒力基因的表达发生了不同程度的变化,同时发现inlA和inlB基因的缺失使LM侵袭HT29结肠癌细胞的能力显著下降（P＜0.05）。本研究成功构建LM的inlA和inlB基因双缺失菌株,并初步研究了基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响,为深入研究内化素InlA和InlB在LM入侵宿主细胞过程中的具体作用提供了支持。     

双基因敲除减毒单增李斯特菌(ΔactA/ΔinlB)的构建及其生物学初步鉴定

减毒单增李斯特菌具有成为疫苗活载体的潜力,可同时引起MHCⅠ和MHCⅡ类抗原递呈系统,具有强烈激发CD8+和CD4+细胞免疫的能力。构建毒力基因缺失菌株进而评估其生物活性对于其作为疫苗活载体的开发尤为重要。本文采用同源重组技术构建单缺失菌株Lm-△act A和双缺失菌株Lm-△act A△/inl B,从生长状态、毒力基因表达和对Hep G2细胞侵袭能力方面探讨减毒菌株生物学特性。生长活性测定显示两种减毒菌株和野生型Lm(EGD-e)三者生长状况无差异;实时定量PCR结果显示act A基因缺失后,inl A基因表达水平上升两倍;act A和inl B基因双缺失后,plc B和hly基因的表达水平都有较大幅度的上升;侵袭Hep G2细胞结果显示act A基因缺失后侵袭能力增强、act A和inl B基因共同缺失后侵袭能力减弱。因此,减毒菌株的构建及其生物特性研究不仅对食源性致病菌Lm致病机理具有重要意义,也为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础。     

生物技术在重金属检测中的应用

综述了酶分析法、免疫分析法、生物传感器等生物学技术在重金属检测中的应用与发展,并对这些技术的优缺点及发展前景进行讨论。随着重金属污染问题的日趋严重以及新兴的生物、化学与物理等交叉学科的发展,重金属检测在传统技术的基础上,衍生出众多快速、灵敏的检测方法,其中以基于生物学的快速检测技术研究较多,并展现出广阔的运用前景。     

食源性致病菌菌膜形成影响因素研究进展

菌膜是微生物黏附在介质表面形成的大量细菌群居的一种生存状态,结构致密的菌膜能够使细菌更强地抵御外界的不利环境而生存下来。在食品工业中,菌膜的形成使污染的细菌难以被彻底清除;而在医学领域,由于菌膜对抗生素的耐药性使其成为许多慢性感染性疾病反复发作和难以控制的主要原因之一。本文综合分析了近年来菌膜形成影响因素的研究成果,并对其研究进展及未来发展予以评述。     

毒力因子InlA和InlB缺失影响单增李斯特菌侵袭宿主细胞和诱导凋亡的能力

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种毒力较强、人畜共患的食源性致病菌,其具有穿透宿主屏障、胞内寄生的特点,因而致死率较高,被其污染的食品容易引发严重的食品安全问题。本研究使用前期构建的LM重要的毒力因子内化素A(internalin A,InlA)和InlB基因缺失菌株,以人结肠癌腺细胞Caco-2和人肝癌上皮细胞Hep G2为研究对象,探究InlA和InlB缺失对LM侵袭宿主细胞和诱导细胞凋亡的影响。实验结果表明,InlA和InlB的缺失使LM侵袭宿主细胞的能力明显降低(P0.05),与野生株相比侵袭量下降超过50%,同时也降低了其诱导宿主细胞凋亡的能力(P0.05),与野生株相比凋亡细胞的比例下降幅度达到30%~50%。本实验确定了InlA和InlB在LM侵袭宿主细胞和诱导细胞凋亡的过程中具有重要的作用,有助于对LM的致病机理以及引起宿主相关免疫反应、诱导细胞凋亡相关分子机制的深入研究。     

活性氧影响单核细胞增生李斯特菌对7721肝癌上皮细胞的侵袭

用还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶抑制剂二苯基氯化碘盐（diphenyleneiodonium chloride,DPI）处理单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）后,用2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯荧光法测定L. monocytogenes中的活性氧（reactive oxygen species,ROS）,结果显示细胞内源性ROS明显降低且有DPI浓度依赖性。进而用ROS产生能力降低的L. monocytogenes侵袭7721肝癌上皮细胞,结果显示：在1～10 μmol/L的DPI浓度范围内,随着L. monocytogenes内ROS水平的降低,L. monocytogenes侵袭7721上皮细胞的能力却随之增长。本研究提示：L. monocytogenes可能和高等动植物一样存在类似于负责产生ROS的NADPH氧化酶,由其介导产生的ROS可能调控L. monocytogenes侵袭细胞的能力。     

单增李斯特菌nox基因的克隆、表达以及功能

以Gen Bank中报道的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)野生型菌株EGDe的nox基因(Gen Bank ID:986631)为研究对象,探讨在高等动植物中普遍存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在Lm中是否也可以介导产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。首先通过诱导nox基因在BL21中表达产生Nox蛋白,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定该蛋白质分子质量;然后构建过表达菌株EGDe-nox,测定ROS产生情况,并使用实时荧光定量-聚合酶链式反应检测nox基因的过表达对Lm毒力基因表达的影响。结果表明,经鉴定Nox蛋白分子质量约为33 k D,过表达菌株EGDe-nox与对照组EGDe的ROS产生量相比并无多大变化,nox基因的过表达会导致与侵袭相关的基因act A、inlA和inlB以及毒力基因prfA的表达上调。由此推测,该Nox蛋白不能独立主导ROS的产量,但其过表达却可以增强毒力基因表达上调。本研究为继续探讨细菌中Nox的作用提供一定的参考依据。     

noxs基因:病原菌菌膜形成及毒力调控的潜在靶点

noxs基因介导产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)是动植物细胞中普遍存在的"胁迫应答信号分子"。有研究表明细菌中也存在类似的noxs基因,当病原细菌面临不良生存环境时,该基因被激活并通过产生ROS来调控菌膜形成和细菌毒力因子,本文对noxs基因及其介导产生的ROS在此过程中的作用予以综述。     

单增李斯特菌入侵宿主分子机理研究进展

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）是四大高风险食源性致病菌之一;是致病菌致病机理研究模式生物;作为典型的胞内寄生菌,Lm可穿透肠道屏障、血脑屏障、胎盘屏障等宿主防御体系,并采用高超的生存策略逃逸宿主防御体系,保证其在宿主细胞内生存繁衍。本文从Lm毒力因子、宿主受体、信号转导等分子机理入手,就单增李斯特菌入侵免疫吞噬细胞、非免疫细胞以及实验动物三方面,对近年来Lm的致病机理研究进展予以评述。