玉米半胱氨酸蛋白酶突变体W308C的原核表达和酶学性质表征

通过对玉米半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease from Zea mays,zmCP1）同源模建和底物对接研究发现,W308位点在木瓜蛋白酶家族（C1家族）高度保守,且位于zmCP1催化三联体残基N306位点附近,与绝大多数底物形成π-π键,可参与底物和酶活性中心的结合,是该酶的关键位点;结合Rosetta design程序设计,对W308位点进行突变,获得W308C突变体,并在大肠杆菌BL21中表达。酶学性质表征实验结果表明：突变体W308C的最适温度为55 ℃,最适pH 6.0;在70、80、90 ℃下的半衰期为75.33、57.24、40.29 min,分别是野生型的1.21、1.19、1.01倍;突变体W308C和野生型的特异性常数Kcat/Km分别为11.02、5.92 L/（μmol·min）,催化活性提高了0.86倍。     

羊肚菌固态发酵玉米蛋白粉的研究

以玉米蛋白粉为主要原料,采用羊肚菌对其进行固态发酵培养,确定羊肚菌固态发酵玉米蛋白粉的培养基配方以及培养条件。结果表明:羊肚菌固态发酵玉米蛋白粉最适培养基配方为玉米蛋白粉30 g、葡萄糖2.5%、Mg SO4·7H2O 0.15%、KH2PO40.25%、含水量65%;最佳培养条件为接种量14%、培养温度25℃、初始p H 6、发酵时间20 d。此条件下,得蛋白转化率为22.36%,菌丝体生物量为0.136 9 g/g。对发酵前后玉米蛋白粉进行氨基酸分析,结果表明:发酵后亲水性氨基酸含量比发酵前提高12.75%。对玉米蛋白粉原料和发酵后玉米蛋白粉进行扫描电镜观察,发酵后的玉米蛋白紧密的结构被打开,表面积增加,表面凹凸加剧,孔洞更为明显。     

玉米半胱氨酸蛋白酶的真核表达及酶学性质表征

玉米半胱氨酸蛋白酶是一种重要的蛋白水解酶,作为C1家族蛋白酶的一员,可在食品、医药等领域广泛应用。本研究从玉米幼苗中提取总RNA,反转录扩增得到玉米半胱氨酸蛋白酶基因,进而构建重组真核表达载体pPICZα-zmCP1,转化毕赤酵母GS115构建重组菌。对表达的玉米半胱氨酸蛋白酶进行酶学性质研究,结果表明该酶最适反应温度为55 ℃,最适反应pH值为6.0,具有较好的热稳定性和有机溶剂抗性,但是pH值的稳定性、金属离子耐受性表现一般。底物特异性研究发现,该酶对小分子底物具有较强的水解能力,且偏爱P1位点为精氨酸的底物。