嗜冷杆菌EastSeaG5-1415脂肪酶基因的克隆和序列测定

从东海深海底泥中筛选到一株产低温碱性脂肪酶的海洋细菌EastSeaG5-1415,经鉴定为嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola。将其染色体DNA用Sau3AI部分酶切后,低熔点琼脂糖回收2～10kb的。DNA片段,用Klenow大片段酶半补齐,与用Sal I酶切半补齐的质粒pUC19连接后,转化E．coli．JM109构建基因文库。用平板测活法从基因文库初步筛选到两株产碱性脂肪酶的阳性克隆,采用ELISA反应进一步鉴定。序列测定分析表明,两个重组质粒中都包含长度为951bp的碱性脂肪酶基因的完整开放阅读框架(ORF)和上游基因调控序列。此片段编码有317个氨基酸组成的酶,计算分子量为35000 Dal。通过Southem杂交证实了此片段来自于嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola EastSeaG5-1415基因细。