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为解决葡激酶存在的溶栓后再栓塞问题,利用PCR介导的定点突变技术,在野生型葡激酶(wt-SAK)N-末端的第3、4位氨基酸之间插入Arg-Gly-Asp(RGD)序列构建了葡激酶突变体MD2-SAK,另将N-末端的前3位氨基酸替换为RGD序列构建了葡激酶突变体MD4-SAK.将突变体基因分别连接表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,经过热激诱导后,突变体均以可溶性形式得到高效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的50%以上.破菌上清液通过SP-Sepharose FF、Sephadex G-50和Q-Sepharose FF三步连续的色谱层析纯化得到纤溶活性分别为10.1×104 AU/mg、11.2×104 AU/mg,纯度均大于96%的突变体蛋白.进一步研究了突变体的性质,结果表明葡激酶突变体不仅保留了野生型葡激酶的纤溶酶原激活活性,并具有较强的抗血小板聚集活性.同时发现,葡激酶突变体的N-末端序列会影响其N-末端甲硫氨酸的酶切加工. 相似文献
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