猪流感复合多表位核酸疫苗的构建及其表达研究

目的构建猪流感病毒复合多表位核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。方法以H3、H9亚型流感的HA抗原表位及流感病毒的其它主要抗原(NP、NA、M)表位基因为基础,再附以Kozak序列和适当的酶切位点,设计并合成一段长765bp的复合多表位基因(Epi),其中各表位基本独立,将其克隆入真核表达载体pIRES1neo,构建重组质粒pIRE-Epi。将多表位抗原基因Epi插入到融合表达基因H57中,构建重组质粒pIRE-H57-Epi。将构建的重组质粒在Hela细胞中表达,并用免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性。结果所构建的融合表达载体pIRE-Epi和pIRE-H57-Epi,在Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白,并具有抗原性。结论已成功构建猪流感病毒多表位基因,有可能成为较理想的猪流感候选疫苗。     

废水生物处理技术及其研究进展

随着经济的快速发展和生活水平的逐渐提高,废水排放量也随之增多,造成的环境污染日趋严重.废水生物处理因其诸多优点而被广泛应用.本文综述了包括厌氧生物处理法、活性污泥法、生物膜法、氧化塘法等废水生物处理技术的原理、特点、分类和应用,介绍废水生物处理法的前沿动态、应用进展及发展趋势.     

水环境中蓝藻毒素研究进展

随着社会的发展,水体富营养化日益严重,藻类及藻毒素严重污染了水环境,不仅给传统净水工艺带来不利影响,增加了水处理难度,而且严重威胁人类健康和生命安全,已成为全球性的环境问题.本文较详细地介绍了蓝藻的起源、特性及其危害,并综述了有关其检测方法及防治措施.最后,对蓝藻毒素降解技术的发展方向进行展望.     

新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建及其原核表达

目的构建鸡新城疫(ND)强毒株多裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法奠定基础。方法人工合成一段包含4种不同NDV强毒株裂解位点的基因Fe(F prote in multitude epi-position),其中各裂解位点之间用Linker(GGGGS)使其串联,然后进行2倍和4倍拷贝,并定向克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28a(+)/4Fe,进行表达和Western blot鉴定。结果构建的原核表达重组质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28 a(+)/4Fe测序正确。Western blot检测结果表明,2Fe、4Fe蛋白均与新城疫强毒株F48E9阳性血清呈阳性反应,而与新城疫弱毒株V4阳性血清呈阴性反应。结论已成功构建NDV强毒株F蛋白裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法提供理论依据。     

编码SARS-CoV S1和S2蛋白的DNA疫苗对小鼠的免疫应答

目的构建编码SARS-CoVS蛋白亚单位S1和S2的核酸疫苗,并检测其对小鼠的免疫应答。方法依据GenBank中SARS-CoV基因组序列,人工合成SARS-CoVS1和S2亚单位基因,分别与CTL表位基因重组后,克隆至表达载体pIRES1neo中,构建DNA疫苗pIRCTL-S1和pIRCTL-S2。将构建的DNA疫苗转染BHK-21细胞,采用间接免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。免疫小鼠后,用流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类数,用ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清中抗SARS-CoV抗体水平。结果所构建的DNA疫苗pIRCTL-S1和pIRCTL-S2转染BHK-21细胞后,均能表达抗原蛋白,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,并诱导产生抗SARS-CoV特异性抗体。结论所构建的两种DNA疫苗在小鼠体内均产生了体液和细胞免疫应答,为SARS核酸疫苗的研制奠定了基础。     

禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)的基因序列和AIV相关的RT-PCR检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-PCR检测方法。根据．AIV HA基因设计了H5、H7、H9亚型的联合RT-PCR引物,其上下游引物分别位于裂解位点两侧,在确定各亚型单项RT-PCR检测方法的反应条件和反应体系的基础上,建立、优化了三联RT-PCR检测方法的反应体系和反应条件,并通过相关病毒、质粒、棉拭子检测,建立了AIV三联RT-PCR检测方法。最终建立了AIV系列RT-PCR检测方法,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为AIV检测、流行病学调查、致病性分析及疫苗使用等奠定了基础。     

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

针对我国口蹄疫(FMD)流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT.该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV 2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因(其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株)作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因.将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒(FPV)表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带OAAT表达金和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDV VP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础.     

检测禽流感病毒RT-PCR一步法的建立及H5、H9亚型的鉴定

目的建立禽流感病毒(AIV)通用型RT-PCR一步法,并鉴定AIV H5和H9亚型。方法根据流感病毒高度保守的M1基因序列,设计一套通用型引物,建立AIVRT-PCR一步法。根据H5、H9亚型HA基因序列,分别设计一套特异性引物,其上、下游引物分别位于裂解位点两侧,应用RT-PCR一步法检测AIV H5和H9亚型,并验证所建立方法的敏感性;通过检测NDV、IBV和IBDV等RNA病毒及计算机软件模拟检测,验证其特异性。结果所建立AIV系列RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便和快速的特点。结论该方法可用于AIV的检测,H5、H9亚型的鉴定及致病性分析。     

重组鸡痘病毒对豚鼠的生物安全性

目的检测重组鸡痘病毒在妊娠豚鼠及其子代豚鼠体内的安全性。方法重组鸡痘病毒以正常剂量和超大剂量同时免疫妊娠豚鼠和子代豚鼠,通过临床观察、病理组织学、PCR等方法,检测重组鸡痘病毒对妊娠豚鼠的毒性和子代豚鼠生长的影响以及子代豚鼠的病毒DNA残留。结果临床观察和病理组织学检测表明在整个实验期间,免疫重组鸡痘病毒的妊娠豚鼠精神状态、饮水、采食等临床表现一切正常,未表现出临床症状和不良反应,未造成早产、流产、死胎、弱胎;用正常和超大剂量免疫重组鸡痘病毒的子代豚鼠均未出现任何临床症状,内脏器官未见明显的病理变化,且未检测到病毒DNA。结论构建的重组鸡痘病毒生物安全性好,对妊娠豚鼠和子代豚鼠无安全威胁。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。