黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。     

新工科与工程教育认证背景下生物工程专业微生物实验教学改革与实践

微生物实验是生物工程专业的专业基础实践课程,具有基础性、技术性和应用性等特征,是培养学生专业实践能力的基石。基于新工科和工程教育认证对高等教育人才培养提出的新要求,本文通过微生物实验课程体系、实验实践教学体系和过程评价体系的创新构建,阐述了微生物实验课程的教学改革与实践。通过实验教学改革与实践,不仅提升了微生物实验课程的教学效果,也培养了学生对专业知识的自主学习能力、理解创新能力和应用实践能力。     

高效毛细管电泳法测定发酵液中林可霉素的含量

应用高效毛细管电泳法对发酵液中的林可霉素的含量进行了测定,研究了检测波长、缓冲液的种类、pH值、浓度以及分离电压等对测定结果的影响。结果表明,在pH8．5的60mmol／L的硼酸．SDS缓冲液,20kV分离电压下,林可霉素的测定效果最佳,线性关系、精密度、稳定性及加样回收率符合要求。本方法简便、快速、准确,适用于含有林可霉素发酵液样品的检测。     

响应面法优化草菇液态发酵菌丝体中总三萜的微波提取工艺

目的:利用响应面分析法对微波辅助提取草菇液态发酵菌丝体中总三萜工艺进行研究。方法:在单因素实验基础上,选取微波功率、提取时间、提取温度和液料比为影响因素,以草菇菌丝体中总三萜提取率为响应值进行响应面分析。结果:草菇液态发酵菌丝体中总三萜的最佳微波提取条件为微波功率720W、提取时间21min、提取温度66℃和液料比36m L/g。在此条件下,草菇菌丝体中总三萜提取率为1.65%。结论:采用微波技术提取草菇液态发酵菌丝体中总三萜的工艺稳定性好,提取率高。     

两种酿酒酵母发酵对桑葚米酒理化品质及香气成分的影响

实验以清酒酵母和果酒活性干酵母为发酵菌种,分别采用单独接种、两种酵母按不同顺序接种和两种酵母同时接种共5种发酵方式发酵桑葚米酒,利用气相色谱-质谱法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)分析5种发酵方式发酵桑葚米酒中香气物质,同时对米酒中主要香气成分进行主成分分析。结果表明:接种清酒酵母发酵7 d后再接入果酒活性干酵母发酵的桑葚米酒品质较好,米酒理化指标为酒精度(10.10% vol±0.20% vol)、残糖含量(30.70±0.10 g/L)、总酸(6.85±0.08 g/L)、挥发酸(0.31±0.05 g/L)、感官评分(85.60±0.19)。5组酒样中共检测出175种香气成分,其中酯类62种、醇类30种、酸类8种、醛类11种、酮类19种、烃类29种、其它物质16种;接种清酒酵母发酵7 d后再接入果酒活性干酵母发酵的桑葚米酒中主体风味物质达14种,典型风味成分β-苯乙醇的相对含量达17.88%,较其他4种发酵方式高出2.63~3.96倍,米酒的香气浓郁,果香花香和奶香味突出。     

重组Taxus chinensis苯丙氨酸变位酶性质表征及R-β-芳香丙氨酸合成

为实现酶法合成高附加值的β-苯丙氨酸,首先化学合成来源于紫衫（Taxus chinensis）的苯丙氨酸变位酶（phenylalanine aminomutase,PAM）基因（Tcpam）,构建大肠杆菌重组质粒Pet-sumo-Tcpam,转入大肠杆菌中进行异源诱导表达,采用镍柱亲和层析制备电泳纯的重组酶TcPAM,用于催化合成R-β-苯丙氨酸。结果表明：重组质粒Pet-sumo-Tcpam成功在大肠杆菌中实现高效表达,获得可溶性的重组TcPAM,经过亲和层析制备出电泳纯的重组TcPAM。质谱和圆二色谱检测分析结果表明,TcPAM能够催化α-苯丙氨酸异构化为R构型的β-苯丙氨酸。TcPAM在最适温度30 ℃、pH 9的条件下,酶活力达到4.11 U/mg,金属离子K＋、Fe2＋和Ca2＋对TcPAM的活性影响较小,而Cu2＋和Zn2＋有强烈抑制性,表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、Triton X-100和Tween 80对重组酶活力影响较小,相对酶活力保持在90%以上。进一步利用TcPAM催化α-芳香丙氨酸异构合成β-芳香丙氨酸,结果表明：苯环上携带不同基团的α-芳香丙氨酸为底物时,苯环上携带供电子基团比吸电子基团的底物转化率更高,底物的α-氨基容易转移至β位,其中4-MeO-β-苯丙氨酸的产率最高,达到45%,为建立酶法合成R-β-芳香丙氨酸提供了参考。     

桦褐孔菌次生代谢产物清除自由基活性成分的分离纯化及初步鉴定

首先采用二苯基苦基苯肼自由基薄层实验法对桦褐孔菌次生代谢产物进行清除自由基活性的研究,发现桦褐孔菌菌株的次生代谢产物具有较强清除自由基的活性。并采用中压液相色谱(MPLC)、凝胶柱层析(SephadexLH-20)、硅胶柱层析和重结晶多种方法对其活性成分进行分离纯化,得到具有清除自由基活性的纯化合物LWZc和LWZf。利用薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(1H-NMR)和液质联用(HPLC-MS)等方法对LWZc和LWZf进行纯度鉴定和结构解析,结果表明:LWZf为一种已知化合物对羟基苯甲酸(C7H6O3),具有较强的清除自由基活性,从桦褐孔菌中分离得到该化合物是首次报道;初步推断LWZc化合物的可能结构为3-乙酰基-4-氨基-苯基-核糖甙(C13H17NO6),是一种新化合物,该化合物的纯品清除自由基的能力相对较弱。