TagS750-Cas9核酸酶的制备及体内代谢分布研究

Cas9核酸酶在CRISPR/Cas9系统中执行切割靶标脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)的重要功能,研究其在体内的代谢行为对活体水平的基因编辑具有重要的指导意义。本工作采用N-羟基琥珀酰亚胺酯键将近红外荧光染料Vivo TagS750与Cas9蛋白偶联,制备了标记率高达99%的TagS750-Cas9融合蛋白。采用荧光强度监测以及琼脂糖凝胶电泳的方法对Cas9蛋白在常见生理缓冲溶液中的稳定性及切割活性进行了鉴定,并将其尾静脉注射到BALB/c小鼠体内,通过监测TagS750-Cas9蛋白荧光强度的变化对其在体内的代谢和分布进行了研究。结果表明:TagS750-Cas9蛋白的体外稳定性良好,表面标记的TagS750并不影响Cas9蛋白的切割活性。TagS750-Cas9蛋白进入体内后,平均血浆消除半衰期(t1/2β)为55 h;主要分布于肝、肾、肺、脾脏中,心脏的分布较少;72 h可被机体完全代谢清除。研究结果为CRISPR/Cas9系统中Cas9核酸酶的体内应用奠定了基础。     

电转条件对Cas9核糖核蛋白基因编辑效率的影响

直接向细胞内输运CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(Cas9 RNP)对于进行各种基因编辑、基因表达调控和DNA/RNA成像具有重要意义。电转是向细胞内导入Cas9 RNP的重要方法。本工作研究了电压、脉冲长度及脉冲次数等电转条件对Cas9 RNP细胞内基因编辑效率的影响,评估了不同电转条件下的细胞存活率。结果显示:电压为1 300 V,脉冲次数为1,脉冲宽度为30 ms时,Cas9 RNP具有较高的基因编辑效率且生物安全性较好。本工作为CRISPR/Cas9复合物进一步的生物医学应用提供了指导依据。     

基于催化聚合的同步辐射X射线成像标签

同步辐射X射线显微成像具有极高的空间分辨率、很好的穿透深度和优秀的能量分辨,因而在纳米分辨细胞成像领域具有巨大的应用潜力。然而,目前X射线显微技术多用于细胞结构成像,而和该技术相适合的特异性识别细胞内重要生物靶标的分子探针仍较缺乏。本工作利用同步辐射X射线良好的能量分辨特点,经体外化学催化反应成功制备了同步X射线可见的成像标签,成像分辨率达到30 nm。研究结果为进一步制备X射线敏感的分子探针,实现对细胞内生物分子的特异性识别和成像打下了良好的基础。