来源于生孢噬纤维菌的新型β-葡萄糖苷酶SmBgl3A的性质研究

通过表达水平分析比较,从生孢噬纤维菌Sporocytophaga sp. CX11基因组中筛选出在菌株降解纤维二糖过程中起关键作用的β-葡萄糖苷酶基因SmBgl3A。该基因含有2 283 bp碱基对,编码760个氨基酸,其编码蛋白质与来源于Bacteroides ovatus的β-葡萄糖苷酶BoGH3B同源性为46.76 %。将该基因在大肠杆菌中进行异源表达,粗酶液经Ni-NTA亲和层析一步纯化得到电泳级纯度的酶蛋白SmBgl3A,重组蛋白质相对分子质量与理论值（81.2×10⁴）一致。酶学性质表征结果表明,SmBgl3A最适温度和pH分别为35 ℃和6.5;pH在5.0~7.0、温度在40 ℃以下时,稳定性较好,同时有着较好的NaCl耐受性。SmBgl3A的最适底物为pNPG,以pNPG为底物时的比活力为14.74 U/mg;K_m为10.88 mmol/L,k_cat为46.72 s< sup > -1。SmBgl3A作为一种新型的、酶学性质优良的β-葡萄糖苷酶,进一步扩展了β-葡萄糖苷酶的种类,为该酶在纤维素降解、食品工业等领域的应用奠定基础。     

生孢噬纤维菌内切葡聚糖酶的异源表达及CBM6对其酶学性质的影响

内切葡聚糖酶是纤维素酶系的重要组分之一,但大部分内切葡聚糖酶酸碱耐受性较差。为挖掘新型内切葡聚糖酶,本研究从生孢噬纤维菌CX11基因组中克隆了一个内切葡聚糖酶基因Sm＿1350。该基因大小为2 196 bp,编码732个氨基酸,编码蛋白包含一个分泌信号肽、GH5催化结构域、6家族碳水化合物结合模块(CBM6)和一个C末端结构域(CTD)。利用实时荧光定量PCR技术对Sm＿1350在不同碳源条件下的相对表达水平进行了分析,结果表明,Sm＿1350在纤维二糖和滤纸培养基中的表达水平均显著高于在葡萄糖培养基中的表达水平,推测其在CX11降解纤维素过程中发挥一定作用。本研究构建了Sm＿1350及其3种截短突变体,分别为Sm＿1350、Sm＿1350-GH5-CBM6、Sm＿1350-GH5和Sm＿1350-CBM6,并在大肠杆菌中进行异源表达。结果表明,去除CTD结构域明显提高了目的蛋白的可溶性表达水平。以CMC为底物时,Sm＿1350-GH5-CBM6与Sm＿1350-GH5酶活力分别为(7 000.00±50.00)U/g和(2 542.73±35.03)U/g,表明去除CBM6降低了Sm...