纤溶酶原饼环区5蛋白重组大肠杆菌高效表达体系的建立

目的　建立纤溶酶原饼环区 5 (Humanplasminogenkringle 5 ,hPK 5 )蛋白重组大肠杆菌高效表达体系 ,为高密度发酵创造条件。方法　观察一级、二级种子的生长状态 ,比较表达hPK 5蛋白的 4种重组工程菌株在相同条件下的表达情况 ,选出首选发酵种子 ;对其培养时间、诱导时间、培养基种类、pH等条件进行优化 ;并用凝胶成像分析系统对SDS PAGE结果进行分析。结果　经过筛选 ,JM10 9 pBV2 2 0 hPK 5 (简称JP5 )是获取hPK 5蛋白的首选工程菌株 ,其最佳表达条件是LB培养基 (pH 7.4、溶解氧充足 )、30℃培养 3h、4 2℃诱导 6h。在此条件下 ,JP5表达目的蛋白占菌体总蛋白的 38%左右。结论　为高密度发酵获取hPK 5蛋白奠定了实验基础     

赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白的纯化及其活性

目的纯化赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白,并鉴定其活性。方法将制备的赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白粗提液透析后,经Bio-CAD CM柱层析系统非连续梯度洗脱,收集洗脱峰,对有活性的梯度洗脱峰样品进行单向聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D-PAGE)及切胶纯化,将切胶回收纯化的蛋白样品进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE),回收蛋白,进行活性和浓度检测。结果透析后的蛋白粗提液经Bio-CAD CM柱层析分离,得到3个不同洗脱梯度的可降解DNA的活性峰,3个梯度蛋白的PAGE带型基本一致,经PAGE分离获得3个核酸酶样蛋白纯品EWD1、EWD2和EWD3,得率和纯化倍数分别为:27.9%,11.6;16.7%,11.2;16.7%,18.6。结论成功纯化了赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白,并保持了其良好的生物活性。该纯化方法简单、快速、经济、实用,为该蛋白结构及功能的进一步研究奠定了基础。     

抗肝癌基因疫苗内毒素去除方法的建立

目的建立去除抗肝癌基因疫苗pVAX1-aLCGV内毒素的方法。方法采用Triton X-114液相分离法去除抗肝癌基因疫苗中的内毒素,鲎试剂法检测疫苗中的内毒素含量,家兔法复试,ELISA法检测内毒素入血前后血浆中细胞因子TNF-α和IL-8的含量及疫苗的免疫原性,并比较处理前后的基因疫苗转染SMMC-7721和HepG2细胞的转染效率。结果经Triton X-114处理后,基因疫苗的内毒素含量及热原检测均合格;内毒素入血后,血浆中TNF-α和IL-8的含量均明显升高;疫苗的免疫原性与处理前比较,差异无统计学意义;处理后疫苗质粒的细胞转染效率增高。结论 Triton X-114能有效去除基因疫苗pVAX1-aLCGV中的内毒素,为其临床应用奠定了基础。     

人脂联素球状结构域(gAd)基因的克隆、融合表达和纯化

目的建立人脂联素球状结构域(gAd)融合组氨酸标签的原核高效表达体系,并分离纯化gAd。方法从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,经T-A克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物,引入起始密码、C端连续6个组氨酸编码序列、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导表达目的蛋白。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定高效表达,表达产物以包涵体形式存在,表达量约占全菌蛋白的19%,用超声破菌,经金属离子(Ni2+)配体亲和层析一步纯化得到了均一蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定得到了较高纯度的gAd。结论已成功表达了gAd融合蛋白,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。     

人肝细胞生长因子β链在E.coli中的表达、纯化及活性测定

目的 为获得重组人肝细胞生长因子β(rhHGF-β)的高效表达体系,分离纯化rhHGF-β,以期研究其在生物学和医学中的作用。方法 从人胎肝组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术,对HGF-β基因加工修饰,与载体PBV220重组,构建rhHGF-β的表达载体,转化大肠杆菌,筛选rhHGF-β的高效表达菌株。对rhHGF-β进行粗纯化,透析复性后MTT法检测生物活性。结果 获得了rhHGF-β完整的cDNA序列,重组克隆的酶切结果与设计一致。目的 蛋白的表达量占全菌蛋白的30％,粗纯化后纯度达90％,复性产物能刺激大鼠肝细胞的增殖。结论 建立了rhHGF-β的表达体系,获得了具有生物活性的rhHGF-β,为进一步大量制备和研究HGF的生物学功能提供了重要的实验数据。     

肿瘤基因疫苗纯化工艺的建立

目的建立肿瘤基因疫苗的纯化工艺,为肿瘤基因疫苗的工业化生产奠定基础。方法采用碱裂解法粗提质粒DNA,利用凝胶过滤层析、亲和层析及离子交换层析分离纯化质粒DNA,并对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果经3种层析柱纯化所获得的超螺旋质粒DNA,其A260与A280的比值在1.85～1.92之间;超螺旋质粒DNA比例不低于94%;内毒素含量远低于10EU/mg;5批纯化的质粒DNA经全面检定,均符合国家质量标准。结论该纯化工艺制备的肿瘤基因疫苗纯度高,且有效去除了内毒素。     

大肠癌相关基因PGDH原核表达质粒的构建及表达

目的构建15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达PGDH蛋白。方法以人正常大肠黏膜组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,转化E.coliDH5α,经温控诱导表达,并经Ni2+-NTA亲和层析纯化,目的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组质粒pBV220-PGDH-His6经PCR及酶切鉴定,证明质粒构建正确。经温控诱导后,可表达出相对分子质量约为29 000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3 h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。Western blot验证了表达蛋白的特异性。纯化后目的蛋白纯度大于95%。结论已成功构建PGDH原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了PGDH蛋白。     

RNA干扰技术对MCF-7细胞Aurora-A基因表达的影响

目的构建针对Aurora-A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并探讨其对人乳腺癌细胞株MCF-7中Aurora-A基因表达的抑制作用。方法将具有短发夹结构的2条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGCsi-U6/Neo/GFP中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行序列测定。并通过脂质体法转染至MCF-7细胞中,48h后观察转染效率,并采用RT-PCR及Westernblot法检测siRNA对MCF-7细胞Aurora-A基因mRNA及蛋白表达的影响。结果测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已被克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,Aurora-A-siRNA质粒转染MCF-7细胞48h后转染效率约为60%,与对照组比较,Aurora-A-siRNA质粒转染的细胞Aurora-A基因mRNA和蛋白的表达均明显下降。结论已成功构建了Aurora-A-siRNA真核表达质粒,其能明显抑制MCF-7细胞Aurora-A基因的表达,为进一步研究Aurora-A基因的功能奠定了基础,并可能为肿瘤的生物学治疗提供新的方法。