加酶洗涤剂的发展概况

阐述了国内、国外加酶洗涤现状，并着重介绍了国内酶的种类、特点及现有生产情况，预测了国内加酶洗涤剂的前景与趋势。     

基于SASV8.1的黄嘌呤氧化酶产酶培养基的优化

培养基优化属多变量目标函数优化,先通过Plackett-Burman法筛选出黄嘌呤、(NH4)2SO4和CaCl2为重要因素,然后采用Box-Behnken设计重要因素水平,同时应用SASV8.1软件做多元非线性回归,建立黄嘌呤氧化酶产酶培养基的优化模型.用模型预测培养基的最优组成.将预测值与验证值相比较,误差为2.6%,证明采用响应面法寻求最佳培养基组成是可行的;并且优化后黄嘌呤氧化酶产酶水平提高了5倍.     

盖子环替换及定点突变提高菜豆环氧化物水解酶对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化性能

菜豆环氧化物水解酶1和2（PvEH1、PvEH2）能够动力学拆分外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚（rac-oMGE）,从而保留(R)-oMGE。基于对PvEH1和PvEH2结构的同源模拟和分析,发现二者分子中的盖子环差异较大,故本文选择盖子环作为研究目标。经融合聚合酶链式反应（FPCR）,获得了PvEH2的盖子环区域被PvEH1对应区域替换的杂合酶Pv2Pv1。用全细胞酶E. coli/pv2pv1催化rac-oMGE,当(S)-oMGE刚好水解完全时,产物(S)-3-邻甲苯基-1,2-丙二醇（(S)-oTPD）的ee_p由PvEH2的58.3%提高至75.5%。为进一步提高酶的性质,在Pv2Pv1中选取11个氨基酸位点进行丙氨酸(A)突变,获得最优突变子E. coli/pv2pv1^K176A,活性为E. coli/pv2pv1（4.2U/g）的2.1倍,且当S构型的底物刚好完全水解时,(S)-oTPD的ee_p进一步提高为80.3%。分子对接分析发现,盖子环替换和K176位点突变为A,均使(R)-oMGE环氧环中的C_α更易受到酶中D101位点的攻击。利用E. coli/pv2pv1^K176A催化150mmol/L rac-oMGE水解制备(R)-oMGE（ee_s＞99%）和(S)-oTPD（ee_p=80.4%）,二者的产率Y_S和Y_P分别为32.7%和60.1%,时空产率STY_S和STY_P为1.6g/(L·h)和3.3g/(L·h)。本实验为改善EH的催化性质提供了一种有效策略。     

毕赤酵母产重组木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学性质

目的优化毕赤酵母工程菌GS115/xyn11A产重组木聚糖酶的发酵条件,并检测其酶学性质。方法采用单因素试验和L(934)正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基起始pH值、诱导剂甲醇添加量、诱导温度及诱导时间对产酶活性的影响;并分析重组木聚糖酶的酶学性质。结果影响重组毕赤酵母产酶的因素重要性依次为:培养基起始pH值>诱导时间>诱导温度>甲醇添加量,重组酵母产酶最佳条件为:起始pH值7.5,甲醇添加量1.5%,32℃诱导96 h,在此条件下进行诱导表达重组木聚糖酶的酶活性可达228.35 IU/ml;酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.5,在低于40℃和pH 4.5～7.5的范围内较稳定。结论优化了毕赤酵母产重组木聚糖酶的发酵条件,为木聚糖酶的工业化生产及应用提供了依据。     

木聚糖酶融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

以来源于Aspergillus usamii E001的高比活木聚糖酶XynⅡ为亲本,采用"中心模板法"将耐高温木聚糖酶TfxA的前31个氨基酸连接在XynⅡ的N端,构建出融合木聚糖酶TPL。将TPL在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,并对表达条件进行了优化,对表达产物的酶学性质进行了分析。结果表明,融合酶TPL最适pH为4.6,最适温度为45℃,和XynⅡ保持一致,但热稳定性有一定提高,在50℃处理10min,TPL和XynⅡ的残余酶活分别为15.72%和6.92%。     

中空超滤浓缩糖化酶的研究

本文介绍了黑曲霉突变株ＷＭＣ－１５糖化酶采用中空纤维超滤膜进行中试规模的浓缩试验，同时，研究了超滤过程中各种控制因素对酶收率及膜寿命的影响，为工业化大生产提供了必要的参数及操作条件。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及发酵条件的优化

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,并对发酵条件进行优化。方法将人工合成的hLY成熟肽基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/hly,经甲醇低温诱导表达后,取发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测,并对培养基初始pH值、甲醇添加量、诱导温度和时间进行优化。结果人工合成的hly测序结果与GenBank中报道的核酸序列完全一致;GS115/hly经PCR鉴定,hly基因已整合入GS115基因组内;经甲醇诱导表达的GS115/hly发酵液上清具有溶菌活性,活性达30U/ml;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约15200处可见目的蛋白条带;GS115/hly的最佳诱导条件为:培养基初始pH5.0,甲醇添加量2.0%,26℃诱导108h。结论在毕赤酵母GS115中表达了具有较高酶活性的hLY,并对发酵条件进行了初步优化。     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的 2 8SrRNA和 18SrRNA条带 .根据PG37所产碱性脂肪酶 (LipPC)N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在 3’端具有poly(A)等所提供的生物信息 ,采用RT PCR技术扩增了LipPC成熟肽和 3’非编码区的cDNA片段 ,并将该PCR产物直接克隆至pUCm T载体中 .序列分析表明 ,LipPC含有 2 5 8个氨基酸残基 ,其中保守的五肽序列为Gly His Ser Leu Gly .进一步采用ClonTech公司的SmartTM PCRcDNA文库构建试剂盒 ,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段 ,从而完成了LipPC完整cDNA的分析测定 .最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至 pGEX 5X 3表达载体中 ,SDS PAGE检测结果表明 ,大肠杆菌BL2 1所表达的GST LipPC融合蛋白质分子质量约为 5 3ku .     

产酸性果胶酶菌株的筛选及产酶条件的研究

从实验室保藏的9株黑曲霉菌株和1株宇佐美曲霉菌株中，通过初筛和复筛获得了一株高产酸性果胶酶菌株一宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）YL-1。YL-1菌株产酶发酵条件为：29℃静置培养72h，期间在24h翻曲1次。采用单因素试验确定了该茵株固态发酵优化培养基组成为：250mL锥形瓶装发酵基料10g（麸皮8g＋豆饼粉2g），食用果胶0．9g，玉米浆0．5mL，吐温-800．15％，（NH4）2SO4 2．0％，KH2PO40．4％（均相对于基料），料水比1：1，自然pH。酸性果胶酶活力最高达4831 IU／g干曲。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的酶学特性

纯化的黑曲霉Aspergillus niger WM20-11所产的酸性β-甘露聚糖酶经Sephadex G-100凝胶过滤层析和SDS-PAGE分别测得相对分子质量为39 000和40 000;IEF-PAGE测得酶的等电点为4.0;最适作用pH值和温度分别为3.5和70℃;糖质量分数19.6%;Mg2 、Ca2 、Li 、Na 、K 对酶有激活作用,Pb2 、Co2 、Fe3 、Mn2 、Hg2 对酶有抑制作用;酶对角豆胶的Km和Vmax分别为66.7 g/L和333μmol/(min.mg);酶蛋白的氨基酸组成中Asp和Glu含量最高;HPLC分析角豆胶酶水解液的主要产物是低聚糖。