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人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性 总被引:3,自引:0,他引:3
[摘 要]目的 克隆人睫状神经营养因子(hCNTF)基因,在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化,获得具有生物活性的hCNTF蛋白。方法 以人染色体DNA为模板,经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列,并克隆进原核表达载体 pBV220,在大肠杆菌 BL21(Gold)中进行表达,产物经 CM-Sepharose FF柱纯化后,以体外培养的鸡胚背根神经节(DRG)测定生物活性。结果 重组表达质粒pBV22Z- CNTF在大肠杆菌BL21(Gold)中获得了非融合的稳定、高效表达,目的蛋白占细胞总蛋白的45%左右,以可溶性和包涵体两种形式存在,表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90%以上;表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。结论 基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础。 相似文献
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目的在毕赤酵母中表达两个临床人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型毒株主要衣壳蛋白L1(HPV 16 L1),并分析表达产物的可溶性及病毒样颗粒(virus-like parcticle,VLP)装配差异。方法将编码两个不同HPV 16毒株L1蛋白的全长基因序列M16和Y16分别重组于毕赤酵母表达载体p Pink LC,构建重组表达质粒Y16LC和M16LC,转化表达菌株p Pink strain 1。重组菌经甲醇诱导后,Western blot分析L1蛋白的表达水平及可溶性。经密度梯度离心结合透射电镜观察,分析VLP装配情况。通过软件pubmed在线Alignment分析两个序列的氨基酸排列。结果两个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证明构建正确。两个序列获得了相似的蛋白表达水平,但Y16的可溶性较差,几乎且无VLP形成;而M16呈现较好的蛋白可溶性及VLP装配能力。Y16与M16有5个氨基酸的差异(H202D、T266A、Δ424S、D441Δ、K452Q)。结论 HPV 16 L1氨基酸的微小改变尽管未对重组蛋白的表达水平产生影响,但显著影响有功能的预期产物的获得。提示在基因重组病毒疫苗研发中,制备VLP时需考虑毒株的选择,甚至主动进行抗原的特定氨基酸的改造。 相似文献
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E.coli表达HEV ORF2编码蛋白第112~607氨基酸片段的免疫原性及其诱生抗体的病毒中和活性 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 探讨E.coli表达的戊型肝炎病毒(HEV)ORF2编码蛋白第112~607氨基酸片段(pORF2-56K)的免疫原性及其诱生抗体的病毒中和活性。方法 pORF2-56K免疫小鼠和豚鼠,用ELISA检测血清抗体效价。将HEV毒种与高效价豚鼠灭活血清在体外孵育后,接种于2BS细胞,用RT-PCR检测病毒RNA的复制情况。结果E.coli表达的pORF2-56K可诱导机体产生高水平的HEV特异性抗体和强烈的免疫记忆。该抗体可在体外有效中和HEV,使之失去在2BS细胞中有效复制的能力。结论 E-coli表达的pORF2-56K具有良好的免疫原性,且其诱生抗体具有中和HEV的能力,可作为HEV重组疫苗的候选抗原。 相似文献
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目的探讨大肠埃希菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)作为新型DNA疫苗递送载体的潜力及价值。方法从大肠埃希菌DH5α的培养上清中经过滤、超滤、超速离心等步骤收集天然分泌的OMVs,采用密度梯度离心法纯化OMVs。将纯化后的OMVs与哺乳动物吞噬细胞及非吞噬细胞进行体外孵育,观察不同细胞对OMVs的摄取效率。通过电击转化方式将带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP转入OMVs中,并与RAW264. 7细胞共孵育,观察OMVs携带真核表达质粒进入细胞并表达绿色荧光蛋白的情况。结果密度梯度离心法可有效纯化OMVs,纯化后的OMVs进入不同哺乳动物细胞的效率不同,进入吞噬细胞的效率高于非吞噬细胞,经电击转化后,质粒DNA可被导入OMVs中,并随吞噬细胞摄取及表达。结论约5 300 bp的真核表达质粒可用电击方式导入OMVs中,并通过OMVs介导该质粒在吞噬细胞中表达,提示OMVs具有作为新型质粒DNA递送载体的潜力。 相似文献
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以改进的Hummers-Offeman法制备出的氧化石墨(GO)与羧基化多壁碳纳米管(CNTs-COOH)为原料,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为交联剂,乙二胺(EDA)为还原剂,水热还原法制得羧基碳纳米管-石墨烯复合气凝胶(CGA)。调整GO与CNTs-COOH的质量比获得密度在8.40~14.42 mg·cm-3之间的气凝胶,并确定在GO:CNTs-COOH=3:1(质量)时得到的气凝胶的机械强度最优。通过扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)对所制备的CGA进行表征,得知GO与CNTs-COOH已成功还原组装成多孔状三维气凝胶结构。以水中乳化柴油作为研究对象,考察CGA样品在不同温度下对乳化柴油的吸附特性。结果表明,CGA的吸附量在前6 min迅速上升,在30 min左右达到吸附平衡,且平衡吸附量随温度升高而增加。吸附过程遵循准二级动力学模型,体系表观活化能为7.10 kJ·mol-1。利用颗粒内扩散模型分析得出,CGA对乳化油的吸附分为外表面吸附过程和内部孔道吸附过程(内部大孔道吸附、中孔道和微孔道内扩散3个阶段)。 相似文献
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目的 研究IL-18在大肠杆菌中高效表达及纯化工艺,并诱导KG-1 细胞产生IFN-γ。 方法利用RT-nPCR从正常人胎肝组织中扩增获得人IL-18基因,克隆于pThiohisA载体,转化宿主菌BL-21,1mmol/LIPTG;诱导,表达产物以包涵体形式存在,经2%Triton X-100洗涤,在 8mol/L尿素下变性阴离子柱层析,透析复性后再经凝胶过滤纯化,通过纯化产物诱导入骨髓瘤单核细胞 KG-l(ATCC CCL-246)产生 IFN-γ,并检测其生物学活性。结果 获得了在大肠杆菌中的稳定高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的25%左右,纯化后纯度可达95%以上,具有显著的刺激细胞产生IFN-γ的活性。结论 制备具有生物学活性高纯度的rhIL-18方法的建立,为基础研究与临床应用开发奠定了基础。 相似文献
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以改进的Hummers-Offeman法制备出的氧化石墨(GO)与羧基化多壁碳纳米管(CNTs—COOH)为原料,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为交联剂,乙二胺(EDA)为还原剂,水热还原法制得羧基碳纳米管-石墨烯复合气凝胶(CGA)。调整GO与CNTs—COOH的质量比获得密度在8.40~14.42 mg·cm~(-3)之间的气凝胶,并确定在GO:CNTs—COOH=3:1(质量)时得到的气凝胶的机械强度最优。通过扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)对所制备的CGA进行表征,得知GO与CNTs—COOH已成功还原组装成多孔状三维气凝胶结构。以水中乳化柴油作为研究对象,考察CGA样品在不同温度下对乳化柴油的吸附特性。结果表明,CGA的吸附量在前6 min迅速上升,在30 min左右达到吸附平衡,且平衡吸附量随温度升高而增加。吸附过程遵循准二级动力学模型,体系表观活化能为7.10 k J·mol~(-1)。利用颗粒内扩散模型分析得出,CGA对乳化油的吸附分为外表面吸附过程和内部孔道吸附过程(内部大孔道吸附、中孔道和微孔道内扩散3个阶段)。 相似文献
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以羧化多壁碳纳米管为基体、纳米硅溶胶粒为增强相,通过一步液相共混方法制备多壁碳纳米管/二氧化硅纳米复合材料。利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、电子扫描电镜(SEM)、热重(TGA)、孔结构分析(BET/BJH)对其进行了表征。以水中柴油为研究对象考察了该样品对水中柴油的吸附脱除效果,并与纳米二氧化硅胶粒、原生碳纳米管以及活性炭进行对比。结果表明:硅溶胶粒表面修饰后的多壁碳纳米管的聚团行为得以改善,而且材料具有微孔-介孔双孔道结构。对水中直馏柴油的去除率高达97.79%,并于1 h达到吸附平衡。整个吸附过程遵循准二级动力学模型,吸附体系的表观活化能为11.37 kJ·mol-1,吸附等温线与Freundlich模型较为吻合,吸附效果明显强于其他3种吸附剂。 相似文献