多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌

目的建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和Taq Man探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌。结果副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的最低检测限分别为72、40、80 cfu/ml。对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致。结论本研究建立的基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测。     

冷冻鲣鱼中产组胺菌的分离筛选及其生物学特性研究

采用Actis’s鉴别培养基,初步筛选鲣鱼组织中的产组胺菌;结合高效液相色谱法分析初步分离菌株的产组胺能力。研究温度和pH因素对产组胺菌生长以及组胺产生的影响。通过生理生化、形态和16S rDNA基因序列分析鉴定产组胺菌。试验结果表明,分离得到两株产组胺菌,分别记为J2和J4。这两株菌在添加L-组氨酸的胰酶大豆肉汤里均能够产生组胺。菌株J2和J4最适生长温度均为30℃,最适pH分别为7和6。菌株J2和J4产组胺的最适温度分别为25℃和30℃,最适pH均为5,在适宜的实验条件下组胺产生量最大值为12.47mg/L。根据菌株的形态、生理生化、生长和产组胺特性以及16S rDNA基因序列分析,J2和J4均与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亲缘关系最近。     

同位素稀释气相色谱-串联质谱法测定动物源食品中克霉唑残留量

建立了动物源食品（猪肉、鸡肉、猪脂肪、猪心、猪肝、猪肾）中克霉唑残留量的同位素稀释气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）测定方法。样品经加速溶剂提取后,用凝胶渗透色谱净化。采用HP-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进行分离,多反应监测（MRM）模式检测,同位素内标法定量。实验结果表明,克霉唑在1~100 μg/L浓度范围内线性良好,决定系数（R2）为0.9995,定量限（LOQ,S/N≥10）为2.0 μg/kg。在2.0、5.0、20.0 μg/kg加标水平下,回收率在82.6%~116.5%之间,相对标准偏差为5.2%~13.5%。该方法灵敏度高、准确性好,能够满足动物源食品中克霉唑残留量的确证和定量分析。     

鲐鱼中产组胺菌的分离筛选与生物学特性初步研究

利用产组胺菌鉴别培养基,对鲐鱼内脏中产组胺菌进行初步筛选,结合高效液相色谱分析方法对分离菌株的产组胺能力进行了确认;并通过菌株的生理生化、形态和16SrDNA基因序列分析对分离得到的菌株进行鉴定;研究了温度和pH对菌株生长和产组胺的影响。结果表明,从鲐鱼中初步分离的4株菌(T4、T5、T6和T9)在组胺发酵培养基中能够产生164.1～466.1μg/100mL组胺;经生理生化特性及16SrDNA序列测定为相同菌种,对其中T4菌株进行进化树分析,发现菌株T4与产粘液变形杆菌相似性最高。T4菌株生长和产组胺的最适温度均为20℃,最适pH均为7。      

离子色谱法同时测定海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐

建立超声辅助提取离子色谱法测定海产品中硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐（包括正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐）含量的方法,对样品中硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐的稳定性进行研究,并采用该法对典型海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐含量进行测定。结果表明：采用亲水性阴离子交换分离柱,KOH溶液为淋洗液作梯度淋洗,硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐的线性相关系数在0.998 1～0.999 8之间,回收率为79.2%～93.6%,相对标准偏差小于8.2%。经处理后的样品中,焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐的总量在14 h内保持稳定。利用该法对东海地区典型海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐进行了测定,结果显示不同品种的海产品中硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐含量分布有较大差异,除其中一份虾制品中多聚磷酸盐含量超过5 g/kg外,其余均符合国家限量标准。     

出口金枪鱼罐头中组胺及微生物控制的HACCP应用技术研究

以金枪鱼(Skipjack Tuna)罐头生产加工过程为例,分析了生产原料及罐头生产流程各环节物料微生物变化情况,部分工艺参数对细菌总数及组胺产生的影响;确定了原料验收、解冻清洗、预蒸煮和配料封罐为主要关键控制点,并制定HACCP计划,建立相应的监控程序和纠偏措施。经HACCP计划实施前后细菌总数与组胺质量分数对比分析,结果表明解冻阶段细菌数减少约30%,成品细菌总数减少49%,成品中组胺质量分数也从3.5 mg/kg降至1.5 mg/kg,同时提高了水产制品卫生品质及保质期。     

阀切换技术-离子色谱法测定水产品中的硼酸盐

建立利用阀切换技术,离子排斥-抑制电导检测器测定水产品中硼酸盐的离子色谱方法。样品经过简单的除蛋白前处理,即可进样分析。采用ICS-1600离子色谱仪(配十通阀),IonPac ICE-Borate离子排斥柱分离,利用阀切换技术,IonPacTBC-1硼酸盐富集柱在线捕获待测成分的同时去除基体干扰,而后进行二次分离。2.5mmol/L MSA+60mmol/L Mannitol作为淋洗液,流速1.0 mL/min,进样量100μL,抑制电导检测。在上述色谱条件下,硼酸的质量浓度在0.1~5.0μg/mL时与色谱峰面积(A)之间的线性关系良好,检出限(S/N=3)为0.02μg/mL。将本方法应用于水产品中硼酸盐的检测,加标回收率为86.5%~93.0%。该方法在线去除基体干扰,简便、快速、准确,可用于实际样品的测定。     

离子色谱法测定食品中的硼酸盐

建立了离子排斥-抑制电导检测器离子色谱法测定食品中硼酸盐的分析方法。样品经过简单的样品前处理,即可进样分析。采用Ionpac ICE-Borate离子排斥柱分离,2.5mmol/L MSA＋60mmol/L Mannitol为淋洗液,流速1.0 mL/min,抑制电导检测。在上述条件下,硼酸的质量浓度在0.02～5.0μg/mL时与色谱峰面积之间的线性关系良好,检出限为0.01μg/mL。将方法用于食品样品的检测,加标回收率为85.0%～92.5%。该方法简便、快速、准确,可用于实际样品的测定     

双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法学研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)同时快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法。针对副溶血性弧菌tox R和霍乱弧菌omp W基因设计特异性引物,优化反应条件,建立水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测方法,并同时应用双重LAMP技术和PCR技术对实验菌株进行副溶血性弧菌和霍乱弧菌检测,比较两种方法的特异性和灵敏度。LAMP的最佳反应温度为61℃,在此条件下,双重LAMP检测技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌DNA的敏感度可达3.12 fg,且与其他常见的细菌株无交叉反应,特异性为100%;对模拟食品样品进行直接检测时检测限为50 cfu/m L;对60份水产样品进行检测时,6份样品出现LAMP及PCR阳性,而传统培养方法检测出4份阳性。实验结果表明所建立的双重LAMP技术在检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌时灵敏度、特异性高,时间成本低,适合于水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的快速检测。