GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶分子系统进化关系分析

为了分析糖苷水解酶第78家族(glucoside hydrolase family 78,GH78)中真菌α-L-鼠李糖苷酶保守区及进化关系,本研究应用Clustal W2软件对87条GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶进行多重序列比对,利用Block Maker进一步分析,得到了该家族真菌的共有完全氨基酸保守位点及保守区;利用Signal P 4.1 Server对序列进行信号肽预测;应用MEGA 6.0软件对Clustal W2结果进行遗传距离分析并构建分子系统进化树。GH78家族真菌87条序列虽然长度不等,但均包含AHGWSTGPTY、VTLDTGQNVAG和NELSIPTDGAKRD 3个保守区及多个完全保守氨基酸位点;87条序列中29条含有信号肽;属间遗传距离为0.7~48.5,种间遗传距离为0.4~48.5;分子系统进化树并不是依靠菌株来源进行聚类,而是依据是否为胞外酶进行聚类。该研究分析了GH78家族真菌α-L-鼠李糖苷酶的保守区及进化关系,为α-L-鼠李糖苷酶的工程改造奠定了基础。     

黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷分子动力模拟研究

L-鼠李糖苷酶能够水解柚皮苷生产普鲁宁和L-鼠李糖,可用于柑橘类果汁的脱苦处理。对柚皮苷和黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶进行分子对接,采用分子动力模拟和MM-PBSA结合的方法计算对接复合物的结合自由能,并分析了分子间相互作用以及各个残基对结合自由能的贡献。结果表明范德华作用力是黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷结合的主要驱动力,库伦电荷作用和非极性溶剂化能对结合贡献较小。Trp236、Ala340、Ile462、Phe461、Tyr516、Val522、Trp528等是黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶和柚皮苷结合过程中形成疏水作用的重要氨基酸残基。在分子动力模拟平衡后的氢键分析中,黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶Ser286、Phe465、Pro520残基和柚皮苷共形成了3个稳定的氢键。本研究分析了黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷结合的驱动力,以及结合过程中重要氢键及疏水性残基,为蛋白质工程改造α-L-鼠李糖苷酶提供了靶位。     

真核α-L-鼠李糖苷酶的碳水化合物结合结构域功能架构分析

为了分析位于CAZy数据库的CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶的CBM的功能,利用Ex PASy网站和MEGA 6.0软件进行CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶的理化性质分析、进化树的构建,发现CBM67家族的真核α-L-鼠李糖苷酶可被分为三大类,且大部分为疏水性蛋白,氨基酸数量范围为239～377个,分子量(Mr)范围为24540.58～40740.16 u,等电点(p I)范围为3.93～8.74,负电荷残基总数范围为20～29个,正电荷残基总数范围6～33个,原子总数范围为3415～5712,亲水性平均系数范围为-0.077～0.377,;通过Clustal X 2.0程序和Espript网站进行序列比对分析确定CBM67家族真核α-L-鼠李糖苷酶CBM所在的氨基酸区域。采用Discovery Studio 2019软件进行同源建模和分子对接,构建出由12个β折叠组成的α-L-鼠李糖苷酶CBM三维结构,与L-鼠李糖进行分子对接的结果表明CBM能够通过与底物产生强的氢键和范德华力来识别底物,促进酶水解反应的发生。这有助于更好的理解CBM识别并结合底物的结构基础与共性规律,从而为提高CBM的结合力提供理论指导。     

α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵及其固定化

在5 L发酵罐中对α-L-鼠李糖苷酶进行小试发酵,制备酶液;以聚乙烯醇-海藻酸钠为包埋载体,以戊二醛为交联剂对该酶进行固定化。经5 L罐高密度发酵96 h,α-L-鼠李糖苷酶酶活为2 766 U/g,生物量为228g/L。经过固定化后,α-L-鼠李糖苷酶的酶活为20 U/g,酶活回收率为32.88%,固定化α-L-鼠李糖苷酶的最适反应温度为35~50℃,最适反应p H值为4.0,该固定化酶在连续使用6次后酶活仍然保留98.22%。高密度发酵能显著提高酶的产量,同时固定化技术提高了酶的重复利用率,为该酶利用芦丁酶法转化制备异槲皮苷提供了依据。     

多点突变提高α-L-鼠李糖苷酶热稳定性

为了提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性,对实验室前期构建的K406R、K440R、K573V、E631F四个不同氨基酸位点的单点突变体进行联合突变,得到了K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-K573V、K440R-E631F四个联合突变体。结果表明,相比于野生型(wild type,WT),联合突变体K440R-K573V和K440R-E631F的热稳定性有所提高,在60℃时半衰期分别提高了1. 13倍,1. 44倍;在65℃的半衰期分别提高了1. 64倍,1. 64倍;在70℃的半衰期分别提高了1. 88倍,1. 68倍。对突变体K440R-E631F进行圆二色谱分析、分子动力学以及分析微观结构变化分析可知,K440R-E631F突变体与WT相比,内部疏水性有所提高,二级结构中α-螺旋、"-转角、无规则卷曲含量增多,可能与热稳定性的提高相关。     

黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶Rha1的二级结构预测及三级结构模拟

本文研究了酶的结构,有利于进一步了解酶的功能,通过对α-L-鼠李糖苷酶Rha1二级结构分析及三级结构模拟,为该酶进行理性设计提供基础。采用GORⅢ、PHD等九个二级结构预测方法对Rha1的二级结构进行分析和预测。结果显示,Rha1二级结构为23.51%α-螺旋,29.77%β-折叠,46.71%无规则卷曲,具有一个与GH78家族相似的(α/α)6桶状结构域及两个β三明治折叠片结构域。利用Swiss-Model以单模板建模的方法构建了Rha1的三维结构模型。根据二级结构的结果,将Rha1分为三个结构域,利用Modeller 9.15以多模板分段建模、结构域拼接的方法构建了该酶的三维结构模型,并对其进行能量最小化优化。利用Ramachandran图以及Verify_3D评估对两种方法构建得到的Rha1的三维结构模型进行评价,其中Swiss-Model构建得到的模型未通过评价,Modeller9.15构建得到的Rha1的三维模型结构合理,通过评价。α-L-鼠李糖苷酶Rha1模型的构建为今后深入研究该酶的结构与功能奠定了基础。     

移动式填充床固态发酵反应器的设计及单宁酶中试发酵

通过对单宁酶固态发酵工艺分析,结合传统厚层通风制曲的结构,设计了移动式填充床固态发酵反应器。利用设计的固态发酵反应器以发酵茶梗为基质中试化生产单宁酶,探究10、15、20 m3/h通风量对单宁酶中试化发酵效果。结果表明:在通风量为10、15、20 m3/h的条件下,发酵达到的最大酶活分别为8.21、8.08、8.41 U·gds-1,达到最大酶活的时间分别96、120、144 h。利用设计的填充床固态发酵反应器以茶梗为基质发酵生产单宁酶,不仅原料来源广泛、价格低廉,还能有效提高单宁酶酶活。