结核分枝杆菌融合抗原Ag85B-ESAT6真核表达载体的构建及鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板,将Ag85B和ESAT6编码基因进行PCR扩增,然后采用基因剪接重叠扩增PCR法(gene SOEing)将其通过疏水甘氨酸接头(GGIGIAPG)连接融合,定向克隆至质粒Pvax1中,构建结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合抗原的真核表达质粒Pvax1/AE.经单双限制性内切酶图谱、PCR产物及DNA测序分析等多种方法鉴定,证实Pvax1/AE真核表达质粒构建成功.为进一步研究其结核核酸疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.     

肝脏特异性基因疫苗研究

本研究构建了肝脏特异性表达的载体,为进一步构建肝脏特异性的siRNA载体做前期准备。通过PCR方法扩增得到人Alpha-1抗胰蛋白酶(human-α1-anti-Trypsin)启动子片段(以下简称hAAT启动子)。回收纯化后克隆到pCDNA6载体中,同时以EGFP作为标记蛋白。将构建好的载体分别转染到肝癌细胞HePG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231和肺癌细胞A549中,验证其在肝脏中特异性表达的能力。然后在荧光显微镜下观察。结果表明:载体在肝癌细胞中能很好的表达EGFP,在肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MDA-MB-231中不表达EGFP。说明采用human-α1-anti-Trypsin启动子可以实现目的基因在肝癌细胞中特异性表达,这项研究应用于抗肝癌、肝炎的siRNA基因治疗,将有利于显著提高治疗效果,减少对身体的副作用。     

特异性siRNA质粒的构建及其抑制癌细胞中mcl-1表达的研究

本文构建了靶向mcl-l基因构建的特异性siRNA重组质粒,在细胞水平检测的其抑制效果,并筛选出能高效抑制mcl-l基因表达的siRNA重组质粒,针对mcl-1的特异性siRNA重组质粒,将其转染到人肝癌细胞HepG2,用Rt-PCR(实时荧光定量PCR)方法和WesternBlot方法分别检测转染前后mcl-1mRNA水平和Mcl-1蛋白表达水平,比较对应不同位点的两个siRNA重组质粒对mcl-1的抑制效果。结果表明,Rt-PCR结果显示对应不同位点的两个siRNA重组质粒对mcl-1均可降低mcl-1mRNA水平,最大抑制效率达70.0%,远高于作为对照非相关组;Western-Blot结果显示转染特异性siRNA重组质粒后Mcl-1蛋白表达受到抑制,最大抑制率为44.2%。合理设计的特异性siRNA重组质粒可大幅度下调mcl-1mRNA水平,能有效抑制Mcl-1蛋白表达。     

整合siRNA技术的结核核酸疫苗的AAV载体构建与浓缩纯化

引进腺病毒相关病毒载体系统(AAV载体系统),并通过PCR、酶切、连接等分子克隆手段将之前对于结核研究的成果转移至该系统中,完成同时具备小干扰RNA( si-Mcl-1)和结核融合抗原(AG85B-ESAT6)表达单位的二重表达载体的构建.转染AAV-293细胞,包装重组AAV病毒颗粒(rAAV)并收集病毒.分别设计另...     

多目标优化的非编码RNA比对及预测

为更好地优化多个代价函数,提出一种多目标模拟退化算法,在运算过程中对多目标进行优化,从而得到边界上不同方向的最优解,介绍进化过程中的非编码RNA结构,并在此基础上提出RNA多重比对及预测并行模型。实验结果表明,该模型能有效提高解的精度和多样性。     

多目标化的非编码RNA比对及预测

为更好地优化多个代价函数,提出一种多目标模拟退化算法,在运算过程中对多目标进行优化,从而得到边界上不同方向的最优解,介绍进化过程中的非编码RNA结构,并在此基础上提出RNA多重比对及预测并行模型.实验结果表明,该模型能有效提高解的精度和多样性.     

基于多目标粒子群的对接函数综合

针对虚拟筛选过程中对接打分函数适应度低及已有数据集不平衡特点,本文提出了基于多目标粒子群优化的对接函数综合评价方法,以求解多个目标和约束条件下的分类器集合权重分配,为解决训练集不平衡状态下分类器优化问题提供了一种有效的方法.实验结果表明该算法提高了虚拟筛选过程中对接打分函数的应用效果.     

膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株中的检测应用

本文通过对膜反向斑点杂交中各杂交条件的摸索,旨在建立一种快速检测katG、rpoB基因突变的膜反向斑点杂交技术.通过验证该技术成功的验证了膜反向斑点杂交技术在检测结核分枝杆菌耐药性上的应用价值.本实验首先应用PCR技术扩增结核分枝杆菌的katG、rpoB耐药基因,然后用膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌的耐药基因,最后...     

高纯度质粒DNA规模化生产流程的建立和改进

通过对质粒提取过程进行分析,探讨质粒提取过程中的影响因素,分析影响质粒质量的因素,以及优化提取工艺流程,并建立质控标准来控制质粒提取过程中带来质量和数量损失,从而制备出高纯度的质粒DNA.温度诱导可以增加质粒DNA的产量,在大肠杆菌对数生长中期进行温度诱导,从37～43 ℃,每间隔1 ℃度进行诱导,结果表明经42 ℃诱导12 h,质粒DNA的产量可以增加66%以上,为降低成本,大规模生产重组质粒提供良好保障.另外对碱裂解粗提质粒的方法和流程进行改进,采取LiCl去除细胞碎片和杂蛋白;PEG8000沉淀质粒DNA从而去除经RNAase消化的RNA;之后利用少量的酚氯仿混合液去除蛋白质;不仅蛋白质,RNA去除干净,而且在实验时间安排上以及试剂使用量上进行控制,达到了贵重试剂使用量少,去除杂质干净的效果,更为后续的精提做好准备.利用凝胶层析,亲和层析,阴离子交换层析依次去除残余在质粒DNA中的蛋白质、RNA、非超螺旋DNA以及内毒素,达到了制备高纯度质粒DNA要求,并且达到了可以在动物实验中进行转染的质量要求.     

环介导恒温扩增法检测肉制品中致病微生物

目的:建立一种食品中微生物核酸快速检测技术,在此基础上开发的简便、快速、灵敏,不依赖仪器适合基层应用的核酸快速检测试剂盒;并探索该试剂盒在肉及肉制品微生物检测中的应用。方法:根据单核细胞增生李斯特氏菌特有的靶序列vir R基因设计引物,采用环介导恒温扩增技术构建检测体系,优化、验证检测的特异度、检出限等指标,并与传统分离培养法比较。结果:本研究中的检测方法及试剂盒能专一的检出肉制品中的单增李斯特菌,对其他近源菌株检测呈阴性结果,检出限达1.81×103CFU/mL,与传统方法具有相同的灵敏度;检测操作简便快速,极少的设备依赖,适合规模推广。