产磷脂酶D工程菌构建及发酵条件优化

该研究构建产磷脂酶D(phospholipase D,PLD)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌,比较4个单启动子(P_HpaⅡ、P₍ylb(F4))、P_2069m、P₄₃)对PLD酶活的影响,摇瓶发酵表明启动子PHpa Ⅱ酶活最高,为0.32 U/mL。进一步以此工程菌作为发酵菌株,通过单因素试验和响应面试验,对该菌株产PLD的发酵条件进行优化。结果表明最佳产酶条件为接种量2.5 mL/dL、发酵温度37℃、硫酸铵质量浓度0.8 g/dL、甘油质量浓度1.94 g/dL、酵母粉质量浓度1.93 g/dL,在此发酵条件下发酵12.5 h,PLD的酶活达到0.85 U/mL,比出发菌株提高62.5%。同时,以环戊基甲醚作为有机相,柠檬酸-柠檬酸钠为水相,利用双相反应体系合成磷脂酰葡萄糖苷(phosphatidyl-glucose,PtdGlc)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG),转化率分别为9...     

冷藏小龙虾优势腐败菌的筛选鉴定及细菌群落结构和多样性分析

以4℃贮藏小龙虾货架期终点筛选武汉孝感小龙虾中优势腐败菌,同时结合高通量测序方法,进一步确定小龙虾中优势腐败菌,并对小龙虾贮藏过程中菌相变化、微生物结构及其多样性进行分析。结果表明：传统培养法从腐败小龙虾中共筛选出10 株腐败菌,包括波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）等;在属水平上,高通量测序法最终确定气单胞菌属（Aeromonas sp.）及希瓦氏菌属（Shewanella sp.）是小龙虾腐败末期相对丰度最大的2 种优势腐败菌;同时,高通量测序结果表明,随着贮藏时间的延长,小龙虾微生物群落丰富度、多样性及均匀度不断下降,这与腐败末期优势腐败菌的大量增长及生长繁殖过程中抑制其他种类微生物有关。     

枯草芽孢杆菌固态发酵虾头制剂对小鼠生长与肠道菌群影响研究

该研究利用枯草芽孢杆菌对虾头进行发酵转化,探究枯草芽孢杆菌固态发酵虾头制剂对小鼠生长指标和肠道菌群的影响.将小鼠分为维持饲料对照组(NC)、维持饲料+0.1％未发酵虾头对照组(MC)和维持饲料+0.1％发酵虾头制剂干预组(MH),进行8周饲喂实验.实验结果显示,未发酵与发酵虾头均具有诱食性,MC组与NC组相比体脂率增加...     

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的异源表达及甘油糖苷的酶法合成

从杆菌状链霉菌中克隆了一个N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-glucosaminidase,NAGase）的编码基因sbnag2550,并将其在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了异源表达。利用镍离子亲和层析得到纯酶后对SbNag2550的酶学性质进行了研究。该酶的最适温度为50 ℃,在45~60 ℃均表现出90%以上的酶活力。SbNag2550还表现出优良的热稳定性,在55 ℃孵育60 h仍能保留将近90%的酶活力。利用SbNag2550催化N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-glucosamine,NAG）和甘油发生逆水解反应,合成了甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷（glyceryl N-acetyl-glucosamine,GNAG）。在最适条件下,反应24 h时转化率达到28.20%,反应72 h时转化率为34.82%。本研究中首次通过酶法合成了GNAG,为其功能研究和应用开发奠定了基础。     

固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备工艺研究

本研究利用实验室筛选的高活性益生菌株Bacillus subtilis OKF-004进行液态发酵培养,通过单因素实验和正交试验探究了最适形成芽孢的液态发酵培养基组分与培养条件,并将所得菌液通过鼓风干燥制备成菌剂,优化确定了制备菌剂的工艺。以包含2.5%玉米淀粉、3%豆粕、2%葡萄糖的培养基在初始pH为6.5、装液量30 mL(250 mL锥形瓶中)、温度32℃、接种量7%的条件下培养时,枯草芽孢杆菌最适合形成芽孢,芽孢数最高可达到1.1×1010 CFU/mL;离心后将菌泥与浓度5%的保护剂甘油以1:7 g/mL的比例复溶制成菌悬液,以虾头粉末作为烘干载体,将载体与菌悬液以2:3 g/mL的比例混合后,于50℃鼓风烘干6 h,所得菌剂存活率最高,可达140.91%。本文研究的液态发酵培养、鼓风干燥的固态微生物菌剂制备方法具有过程简便、成本低廉、节省能源的特点,适合工业化生产。     

蒸汽爆破预处理联合壳聚糖酶制备壳三糖

为解除壳聚糖底物的不溶解性对壳聚糖酶的限制,并实现单一聚合度壳寡糖的绿色制备,该研究对壳聚糖进行蒸汽爆破预处理,随后使用在枯草芽孢杆菌WB800中高效表达的壳聚糖酶Csn-But进行酶解。扫描电镜结果显示,经过2.4 MPa蒸汽爆破处理的壳聚糖显示多刺的纤维状细枝排列,且表面被明显撕裂,分离和暴露的纤维中含有多个空腔。傅里叶变换衰减全反射红外光谱结果显示蒸汽爆破处理后壳聚糖的化学键未被破坏,氢键网络被破坏。使用壳聚糖酶Csn-But酶解在2.4 MPa蒸汽爆破压力下处理的壳聚糖48 h后,壳寡糖含量较未预处理对照组提高5.4倍,产物浓度达到2.0 mg/mL。并通过调控底物浓度,在作用6%浓度的底物时,实现了高纯度壳三糖的制备。     

固态酶型时间温度指示器的研发

目的开发出一种新型的以酪氨酸酶酶促褐变原理为基础的固态酶型时间温度指示器(time-temperature indicator,TTI)。方法通过单因素实验,确定各因素的取值范围,并建立以TTI指示时间为响应值,以酪氨酸含量、酪氨酸酶含量以及聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)浓度为自变量的数学模型。结果根据响应面模型预测,确定了TTI达到最长时间时各因素的取值:酪氨酸30.08 mg,酪氨酸酶0.30 m L,PVA15.18%,此时TTI的最长指示时间可以达到50.48 h。结论优化了固态酶型时间温度指示器,并确定了该指示器的最长指示时间,为该指示器的应用提供了基础。     

磷酸化南极磷虾肽调控Wnt/β-连接蛋白通路改善大鼠骨质疏松症

目的:研究磷酸化南极磷虾肽(PP-AK P)对双侧去卵巢骨质疏松症模型大鼠的改善作用及其机制。方法:采用双侧卵巢切除法建立骨质疏松症大鼠模型,将SD大鼠随机分为5组:假手术组(生理盐水)、模型对照组(生理盐水)、阳性对照组【阿伦磷酸钠1 mg/(kg·d)】和磷酸化南极磷虾肽低、高剂量组【400,800 mg/(kg·d)】,灌胃12周后,分别检测血清骨代谢相关指标、骨密度及骨组织形态学;测定Wnt/β-连接蛋白信号通路关键基因m RNA和蛋白的表达。结果:磷酸化南极磷虾肽能显著下调去卵巢骨质疏松症大鼠血清中骨源性碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OCN)和骨形态发生蛋白(BMP-2)的分泌(P0.01),降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和I型胶原羧基端交联肽(CTX-I)水平(P0.01),降低去卵巢大鼠骨代谢的高转换率;显著提高模型大鼠股骨骨密度(P0.01),并能显著增加骨小梁厚度和面积,降低骨小梁间距,改善骨组织微观结构;q RT-PCR检测结果表明,磷酸化南极磷虾肽能显著降低LRP-5b、β-连接蛋白、RUNX2、OSX m RNA的表达水平;免疫印迹检测结果表明,磷酸化南极磷虾肽能显著降低LRP-5b、β-连接蛋白总蛋白、β-连接蛋白核蛋白及RUNX2蛋白的表达。结论:南极磷虾肽能显著改善双侧去卵巢大鼠骨质疏松症,其作用机制与下调Wnt/β-连接蛋白通路,降低骨质疏松症大鼠高骨转换速率有关。     

pH值响应性羧甲基琼脂糖-聚多巴胺水凝胶制备及缓释性能

开发一种pH值响应性羧甲基琼脂糖-聚多巴胺（carboxymethyl agarose-polydopamine,CMA-PDA）水凝胶载体。通过氯乙酸取代法合成了CMA。采用红外光谱、核磁共振、电子显微镜和热重分析对CMA的理化性质进行表征。进一步通过冷凝方法制备CMA-PDA水凝胶,系统研究CMA-PDA水凝胶的流变性能和质构性能进行表征。结果表明,PDA的加入提高了水凝胶的凝胶强度、硬度和黏弹性。以阿霉素为模型,研究该水凝胶在pH 2.0、6.2、6.8、7.4条件下的释放行为,表明其具有较好的pH值响应性,pH 2.0条件下的释放率显著高于其他条件。同时以L929细胞为模型,研究该水凝胶的生物相容性,表明其无明显细胞毒性。这项研究证明了CMA-PDA水凝胶生物相容性良好,具有pH值响应性和缓释性能,可以作为潜在的生物活性物质递送载体。     

壳聚糖酶的基因克隆表达及酶学性质研究

作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp. MC2013的壳聚糖酶基因,命名为BUT,该壳聚糖酶基因大小为903 bp,编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现,该壳聚糖酶（BUT）属糖苷水解酶46家族（后简称GH-46）,与其它壳聚糖酶相似度为59%,是一种新型的壳聚糖酶。序列经密码子优化后进行全基因序列合成,与表达载体pET21a（+）连接构建重组质粒pET-21a-BUT,转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）表达宿主,进行诱导表达。所得重组壳聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,SDS-PAGE确定其蛋白分子量为35 kDa,DNS法测定其酶活为146.0 U/mg。对BUT酶的酶学性质进行探究,结果表明BUT酶最适温度和pH分别为45 ℃、8.0,在中性偏碱性条件下稳定性较强。Mn2+对其酶活力具有促进作用,SDS、Fe3+、Cu2+、Zn2+等的抑制作用极强。通过TLC对其水解产物分析发现,BUT水解壳聚糖的产物是壳二糖、壳三糖和壳四糖。