1 株产单宁酶嗜热真菌的鉴定、酶学性质分析及碳水化合物活性酶表达

对产单宁酶的1 株嗜热真菌HBHF5进行鉴定,开展单宁酶酶学性质的分析及碳水化合物活性酶（carbohydrate?active enzymes,CAZymes）的转录组学研究,探究嗜热真菌HBHF5在食品酶制剂开发中的潜力。经对菌株的菌落、孢子形态观察及ITS序列比对分析,最终鉴定嗜热真菌HBHF5为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。经分析,菌株HBHF5在固态发酵培养时不产单宁酶,而液态诱导培养时,菌株HBHF5胞内和胞外均检测到单宁酶活性,且以胞外酶为主（94%）,酶活力最高达136?U/mL。单宁酶最适反应温度为60?℃,在60?℃处理30?min,能够维持酶原活力的90%以上。该酶最适反应pH值为6.0,在pH?5.0～9.0范围内,能够维持60%以上的酶活力。不同金属离子对酶活力的影响存在差异,Cu2＋、Fe3＋、Mn2＋和Zn2＋对该单宁酶活性抑制较强。经转录组学分析,该菌以麸皮为唯一碳源时,共有淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等239?个CAZymes基因表达,其中糖苷水解酶类最为丰富,约占CAZymes表达总数的70%。A. fumigatus HBHF5是1 株优良产酶菌株,为具有食品酶制剂开发潜力的嗜热真菌。     

利用组成型表达载体pMG36e电转化德式乳杆菌保加利亚亚种的研究

以典型的乳酸菌组成型表达质粒pMG36e为载体,德式乳杆菌保加利亚亚种为受体.采用电转化方法研究受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,以提高电转化效率.结果表明:选择含2.5%甘氨酸的SMRS培养基培养受体细胞至对数中期,收获制成感受态细胞,在电场强度12 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF条件下电击转化,以含20 mmol/L MgCl2、CaCl2的SMRS培养基复苏培养2 h,涂板筛选得到较高的电转化效率.特别是采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率提高30倍以上,达到6.3×104cfu/μg DNA.本研究结果为进一步构建乳酸菌组成型高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株提供试验依据.     

毕赤酵母单宁酶工程菌在固、液发酵中的性质差异分析

探究固、液发酵方式在重组毕赤酵母单宁酶工程菌的形态、产酶量及酶学特性等方面的差异。研究发现，重组菌株在固、液发酵方式下表现出了较大差异。固态发酵条件下，重组菌株能够积累更多的生物量，当培养48 h后积累的生物量比液态发酵高22.3%；经电镜分析发现，固态条件下，重组菌株个体之间更容易出现聚集，并伴随着有生物膜的产生；在不同甲醇体积分数诱导下，固、液发酵的重组菌株的产酶量均出现了先升高后降低的趋势，而诱导两者最高产酶量的甲醇体积分数却存在差异，分别是2%和3%。进一步研究发现，固、液发酵条件下，重组菌株发酵的单宁酶酶学性质也存在一定差异，固、液态发酵单宁酶的最适反应温度分别为30 ℃和为20 ℃，且酶的热稳定性也有一定提高，其余酶学性质差异不显著。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析发现，固态发酵生产的单宁酶存在不同的修饰，这可能是造成上述性质差异的原因之一。综上所述，本研究探究了固、液发酵条件下，重组单宁酶毕赤酵母菌株生长及产酶特性的差异，为高效制备单宁酶提供了一定的理论指导。     

甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的性质差异分析及对多糖的协同降解

分析烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HBHF5来源的GH5家族甘露聚糖酶AfMan5A和微孢根霉（Rhizopus microsporus）GZHF10来源的GH134家族甘露聚糖酶RmMan134C的酶学性质差异,探究两者协同降解多糖的潜力。结果表明两者酶学性质差异较大,AfMan5A的最适温度和pH值分别为60 ℃和6.0,而RmMan134C最适温度和pH值为35 ℃和5.0。金属离子Cu2＋、Zn2＋和Mn2＋均表现出对2 个酶活性的抑制,而Mg2＋、Fe3＋和Li＋可促进AfMan5A活性,却对RmMan134C活性表现出轻微抑制。甘露聚糖酶RmMan134C较AfMan5A底物谱广,两者最适底物均为魔芋葡甘露聚糖。进一步研究发现,两者并未对甘露聚糖类底物表现出协同效果,而是在微晶纤维素的降解中表现出较好的协同作用,协同系数为6.1。本研究分析了GH5和GH134家族甘露聚糖酶的性质差异及降解多糖的协同效果,为甘露聚糖酶的进一步应用推广提供一定的理论支持。     

干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳工艺及其产品质量分析

针对目前益生菌发酵乳制品多为混合菌种发酵动物源乳制品的研究现状,本研究以燕麦为主要原料,通过制备纯燕麦乳,酶解,添加20%牛乳和7%蔗糖以及适量乳化剂与稳定剂,组成发酵培养基,以发酵乳制品中选育出的生长繁殖力强,发酵活力高的干酪乳杆菌05-20为试验菌株,研究接种量、发酵温度、发酵时间等单因素对干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳产品质量的影响。采用响应面试验优化干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳产品的工艺条件,分析干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳的产品质量,包括:感官、理化与营养成分、益生菌活菌含量与功能性成分、食品安全性、贮藏稳定性。结果表明:干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳的最适工艺条件为:接种量5.0%,发酵温度37℃,发酵时间5.3 h。该发酵乳呈微黄色,质地均匀细腻,酸甜可口,具有浓郁的燕麦香气和发酵香气,发酵乳活菌数达8.8×108 CFU/mL,滴定酸度49.05°T,蛋白质含量1.76 g/100 g,脂肪含量0.75 g/100 g,必需氨基酸含量占总氨基酸含量的55.92%,不饱和脂肪酸含量约占总脂肪酸含量的79.20%,燕麦β-葡聚糖的含量(92.00±1.29)μg/mL,总酚含量(13.00±0.38)μg/mL,抗消化物质质量分数(19.61±0.02)%,未检测出致病微生物和毒素,保质期为24 d。研究结果为工业化生产以植物蛋白燕麦为主的干酪乳杆菌纯种发酵乳制品提供了理论依据,也为新型益生菌发酵其它植物蛋白乳制品提供了新途径。     

人源弹性蛋白酶基因真核载体构建及表达

从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR（RT—PCR）扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM—Teasy载体中。然后用限制性内切酶EcoRI和NotI对重组质粒pGEM—Teasy／ELA2B和毕赤酵母质粒pHC9K进行双酶切,并且通过PCR技术去除ELA2B的信号肽,成功构建了真核表达载体pPIC9K／ELA2B,并将其转入毕赤酵母表达宿主GS115中。得到150株转化子,经含不同浓度G418的YPD平板筛选获得20株高拷贝转化子。甲醇诱导表达后．发酵液上清经SDS—PAGE检测,获得了大小约为28ku的目的条带。通过酪蛋白平板检测发酵液上清,出现透明圈．初步证明获得了有生物活性的弹性蛋白酶。     

乳酸菌摇瓶增殖培养工艺研究

采用自行筛选的适用于作为高效冻干酸奶发酵剂的嗜热链球菌S.t-SY和保加利亚乳杆菌L.b-DR为出发菌株,在优化的麦芽复合汁增菌培养基上进行摇瓶增殖培养。通过研究培养温度、培养方式、基质起始pH值、接种量、中间补料方式等因素对乳酸菌摇瓶增殖培养的影响,优化乳酸菌摇瓶增殖培养的工艺条件。试验结果表明:在麦芽复合汁增菌培养基中乳酸菌增殖培养的最适条件是:培养温度37℃,基质起始pH值6.5～7.5,接种量0.2%～0.3%,静置培养16h,收获期S.t-SY和L.b-DR活菌数分别达到2.93×109、2.74×109cfu/mL。本试验结果为乳酸菌进一步应用麦芽复合汁增菌培养基生产高效浓缩直投式发酵剂提供了技术参数。     

甘露聚糖酶RmMan134B与非均相湿热技术协同制备魔芋甘露寡糖

为挖掘新型GH134家族来源的甘露聚糖酶，评价其与非均相湿热技术协同制备魔芋甘露寡糖的应用潜力，从小孢根霉GZHF10的基因组中成功获得1个新型GH134家族甘露聚糖酶（Rm Man134B），该基因编码181个氨基酸和1个终止密码子，经分析，与已报道的GH134家族活性基因的序列一致性较低（<69.6%）。采用大肠杆菌PET表达系统对该基因进行异源表达及性质测定，结果表明，该酶最适底物为魔芋甘露聚糖，最适温度和pH值分别为40℃和5.0。将魔芋粉在115℃和0.1 MPa的条件下进行非均相湿热处理，魔芋聚糖的结构和性质发生显著改变，其中处理2 h魔芋粉的溶液的表观黏度（30 g/L）降低96.1%，粉末粒径变小，热稳定性提高，改性魔芋粉的水解率提高0.6～1倍。进一步研究发现，Rm Man134B酶解产物的主要成分为单糖（0.922 mg/L）、二糖（1.4 mg/L）和三糖（0.613 mg/L）。本研究对魔芋甘露聚糖资源的高效利用和产业化发展具有一定的推动作用。     

雷山鱼酱酸中微生物多样性及品质特性分析

采用高通量测序技术对雷山鱼酱酸中的细菌16S rDNA V3-V4 区进行测序,采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术检测鱼酱酸中的挥发性组分,并利用统计学分析计算其品质特性。经分析,雷山鱼酱酸中共有22个门,249个属,变形菌门(39.13%)和厚壁菌门(30.68%)是雷山鱼酱酸中的优势细菌门;节杆菌属(Arthrobacter,11.246%)和雷尔氏菌属(Ralstonia,10.929%)是优势细菌属。经测定,雷山鱼酱酸中含有萜烯类33.65%、醚类33.53%、醇类16.45%、酸类7.82%、酯类6.47%等70种挥发性成分。其中茴香脑(23.25%)、右旋萜二烯(13.12%)、4-烯丙基苯甲醚(8.52%)、芳樟醇(8.35%)、山梨酸(5.96%)为主要的挥发性成分。鱼酱酸品质分析表明,有机酸中柠檬酸含量最高为269.6 mg/kg,脂肪酸以亚油酸(0.047 g/100 g)为主,氨基酸中以鲜味氨基酸为主要呈味特征。本研究结果为探究鱼酱酸发酵机制,规范其生产和食品安全提供了理论依据。     

利用内源性插入序列IS1构建thyA缺陷型大肠杆菌

为获得由大肠杆菌内源性IS1序列插入胸腺嘧啶合成酶基因thyA而产生的胸腺嘧啶营养缺陷型的菌株,利用4%的葡萄糖和1.25μg/mL链霉素的培养基提高IS1的插入频率,以三甲氧苄胺嘧啶(TMP)法定向筛选thyA缺陷型菌株。通过PCR扩增与DNA测序分析突变基因的结构;测定thyA缺陷型菌株在含或不含胸腺嘧啶的基础培养基上的生长曲线以研究其生长特性;转化大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体衍生的含外源thyA基因的互补质粒pMG36e-thyA,采用抗生素抗性基因与质粒上互补的thyA基因两种方法筛选转化子,检测突变菌株在基础培养基上的恢复生长情况。诱导增加IS1的转座频率后,以含3μg/mL的TMP的GSCTt筛选培养基得到thyA缺陷型菌株,将该菌株命名为D8。PCR扩增结果显示,该突变株的thyA基因比正常基因长约800bp,测序结果显示该基因内部插入了完整的IS1序列。D8菌株需依赖外源胸腺嘧啶才能在基础培养基上生长,当转化入pMG36e-thyA后,可利用质粒上的互补基因恢复在基础培养基上的生长性能。大肠杆菌内源性插入序列IS1可插入thyA内部使该基因沉默,为利用内源性插入序列构建缺陷型菌株提供了科学基础。