定点突变的谷氨酰胺合成酶的表达条件和在酶法合成谷氨酰胺中的应用

针对酶法生产谷氨酰胺中高浓度铵盐条件下的谷氨酰胺合成酶（GS）腺苷酰化问题,从谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 14067调取编码GS的基因glnA,将GS的腺苷酰化位点Tyr405定点突变为Phe405,并在大肠杆菌中表达突变后的GS,优化产酶条件。用突变的GS在摇瓶中进行酶催化过程,通过补加酶催化底物谷氨酸钠和氯化铵,可以提高定点突变的GS生产谷氨酰胺的能力,谷氨酰胺产量达到16.8 g·L^-1;在5 L反应器规模的酶催化生产谷氨酰胺过程中,通过调控底物补加方案和反应条件,谷氨酰胺的产量达到34.2 g·L^-1,谷氨酰胺对谷氨酸的摩尔转化率为96.3%。     

除草剂靶酶-天冬酰胺合成酶特性及其抑制剂的研究进展

天冬酰胺合成酶是2000年发现的除草剂环庚草醚靶标酶,在植物体中,天冬酰胺合成酶是催化天冬氨酸和谷胺酰氨生成天冬酰胺和谷胺酸,而天冬酰胺义是重要的运输氮化合物。现义明确天冬酰胺合成酶是由两部分组成：N基末端的两个反平行式β-折叠片层巾的楔形部分是负责水解谷氨酰胺的活性部位;C基末端负责结合Mg^2＋ATP和天冬氨酸。在芳香族植物巾发现单萜化合物有抑制天冬酰胺合成酶的作用,化学合成1．4-桉树脑衍生物也有一定除草活性。     

嗜盐单胞菌利用乙酸盐合成PHB的研究

首先测试了嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD1.0对乙酸钠的耐受性,结果显示乙酸钠浓度由25 g·L^-1提高到100 g·L^-1时对TD1.0生长的抑制率只有45.8%。在摇瓶培养中,TD1.0在36 h内消耗完27.3 g·L^-1乙酸钠,细胞干质量达到9.6 g·L^-1,其中PHB质量分数为61%,表明该菌株具有很好的高浓度乙酸钠耐受性和利用乙酸合成PHB的特性。随后为进一步提高乙酸钠的利用速度,在TD1.0中分别用高拷贝和低拷贝表达载体表达了来自枯草芽孢杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs,结果显示,含有高拷贝表达质粒的菌株TD-PN59的乙酸盐平均利用速率为0.91 g·L^-1·h^-1,比 TD1.0提高了19.7%。TD-PN59的细胞干质量和PHB质量分数分别达到9.98 g·L^-1和65%,PHB产量达到6.49 g·L^-1,比TD1.0提高了约10.8%。在以葡萄糖和乙酸钠为混合碳源(10 g·L^-1 Glu和10 g·L^-1 NaAC)的培养基中,利用低拷贝载体表达acs的TD-PN85菌株的乙酸钠利用速率显著高于TD1.0,并且在一定程度上缓解了碳分解代谢物阻遏现象(CCR),促进了葡萄糖和乙酸钠的共利用。     

牛磺酸对肥胖大鼠甘油三酯和胆固醇代谢的影响

目的 探讨长期经饮水方式补充牛磺酸对高脂膳食所致肥胖大鼠降脂减重作用,对甘油三酯合成关键分子和胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1)表达调控关键分子的影响。方法 根据血清胆固醇水平和体重, SD大鼠被分为3组,为对照组(normal, N)饲喂基础维持饲料,肥胖组(high fat, HF)和牛磺酸组(high fat taurine, HFT)饲喂高脂饲料。N组和HF组自由饮水,而HFT组给予牛磺酸溶液代替水,持续12周。结果 与HF组相比,给予牛磺酸的HFT组大鼠体重、附睾周围脂肪重量、血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸、固醇调节元件结合蛋白-1c (sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)基因表达显著降低,粪便胆汁酸水平、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)活性以及CYP7A1和Ser63p-c-Jun的蛋白表达显著增加,但肝细胞核因子4α(hepatocyte...     

细菌纤维素合成与鉴定研究综述

细菌纤维素（BC）因其独特性能被广泛应用于医药、食品等领域,目前其高产量菌株筛选、合成成本降低及合成途径改良等成为研究热点。本文依据国内外文献并结合团队研究成果对BC合成与鉴定的相关研究进行综述。首先对BC合成菌筛选及碳源利用的研究进行了分析,总结了降低BC合成成本的研究思路。其次对鉴定菌株合成产物的方法进行了归纳,总结了不同方法的特点。然后结合本团队筛选出的BC生产菌XJL-06-4 BC合成酶基因分析结果,综述了BC合成途径、合成酶存在形式以及基因水平调控作用,为BC在分子水平上通过改变合成途径提高产量提供新思路。最后,总结BC微生物发酵生产存在的问题,多角度提出解决方案。     

染料木黄酮抑制3T3-L1细胞成脂分化机制

目的：研究染料木黄酮是否通过雌激素受体介导影响3T3-L1前脂肪细胞成脂分化,并探讨其可能的机制。方法：以不同浓度染料木黄酮处理3T3-L1细胞,四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法测定细胞存活率;在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中分别加入不同浓度染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780（一种雌激素受体抑制剂）混合物及不同浓度雌二醇,油红染色观察分化结果,测定细胞甘油三酯（triglyceride,TG）含量;染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780混合物及不同浓度雌二醇处理诱导成熟后的脂肪细胞,测定培养液甘油含量;分别用染料木黄酮（30 μmol/L）、染料木黄酮（30 μmol/L）和ICI182780混合物干预细胞成脂分化,Western blotting法检测细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、p-ERK、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）、p-AMPK、激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase,HSL）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）蛋白表达量。结果：3T3-L1细胞存活率随染料木黄酮浓度的升高而降低,50～200 μmol/L染料木黄酮能抑制细胞生长（P＜0.01）;染料木黄酮能负向调节成脂分化后细胞胞浆内TG含量,在0～50 μmol/L浓度范围内呈剂量依赖关系,高剂量雌二醇（100 nmol/L）能下调TG含量;染料木黄酮能促进成熟脂肪细胞脂解,提高细胞培养液甘油浓度;染料木黄酮（30 μmol/L）能上调p-AMPK、HSL蛋白表达,下调FAS蛋白表达（P＜0.01）,对ERK、p-ERK、AMPK表达量无明显影响（P＞0.05）。ICI182780（1 μmol/L）能部分阻断染料木黄酮（30 μmol/L）对p-AMPK的调节作用（P＜0.05）。结论：染料木黄酮能抑制3T3-L1细胞成脂分化,其机制可能是染料木黄酮一方面下调FAS蛋白表达,抑制脂肪合成,另一方面激活AMPK-HSL途径促进脂肪分解;染料木黄酮还可能通过非雌激素受体途径抑制3T3-L1细胞成脂分化。     

调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能单糖。在利用枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的过程中,乙酸的积累严重抑制了细胞生长和GlcNAc合成。为了获得高效利用乙酸生产GlcNAc的微生物细胞工厂,作者通过突变乙酰CoA(Ac-CoA)合成酶编码基因acsA 5′UTR区域内全局转录调控因子CodY结合序列,调控acsA转录水平,进一步突变AcsA乙酰化调控位点,解除乙酰化修饰,促进乙酸转化为Ac-CoA,最终乙酸积累量由6.3 g/L减少到3.6 g/L,同时细胞干重(DCW)由2.7 g/L增加到5.3 g/L,GlcNAc产量由1.9 g/L提高到5.0 g/L,为进一步获得高产GlcNAc细胞工厂提供了基础。     

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌基因crtE编码GGPP合成酶。通过PCR扩增获得crtE基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtE。重组质粒转化E.coli BL21(DE3),构建工程菌;重组GGPP合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达,表达量占菌体总蛋白的42%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子亲和层析树脂纯化,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为34kDa,pI值为6.3。     

在线氮饥饿处理对谷氨酰胺合成的促进作用

氮饥饿处理是提高谷氨酰胺合成酶活性的重要手段 ,文中设计了在线氮饥饿处理过程 ,考察了氮饥饿处理对谷氨酸棒杆菌突变株NS61 1的谷氨酰胺合成酶活性及谷氨酰胺合成能力的影响。当初始氮源的供应量受到限制时 ,菌体在生长后期处于氮饥饿状态 ,这种氮饥饿处理使菌体内的谷氨酰胺合成酶的活性提高 2倍以上 ,而谷氨酰胺的累积量提高了69%。