人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.     

鲤鱼(Cyprinus Carpio) 促性腺激素基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从鲤鱼脑垂体获得了两种GtH β亚基的cDNA, 克隆在pMD18-T载体.经测序确证后,将这两个基因克隆到原核表达载体pET -32(a)中,转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白的高效表达.利用初步纯化后的抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.应用制备的兔抗血清与抽提的鲤鱼脑垂体的总蛋白分别进行Western-blot及ELISA分析,结果显示获得的多抗能特异识别各自的天然蛋白.该结果为纯化天然GtH蛋白提供了有效的检测手段,为进一步制备GtH单克隆抗体奠定了基础.     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

Discovery and characterization of tyrosinases from sea anemone pedal disc

Abstract

The formation of underwater adhesion is a complicated physiological process and many different types of enzymes are found to be essential apart from structural proteins. Previous studies have shown that various tyrosinases were present in marine adhesives, but little information is available about the over-expression and enzymatic characterization of these enzymes. Specifically, this study first identified four significantly up-regulated tyrosinases in the pedal disc of Haliplanella luciae by means of multi-omics technology, and made preliminary bioinformatics predictions. Sequence alignment showed that the Tyr1_Hl contained six conserved His residues that bind to copper ions, of which a tyrosinase with diphenolase activity named as Tyr1_Hl^Δ, was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) cells and purified by affinity chromatography. Enzymatic characterization showed that the activity of Tyr1_Hl^Δ was Cu²⁺ dependent and maximum catalytic activities were in 20?mM Tris–HCl (pH 8.0) at 37?°C. In summary, we identified novel tyrosinases in the pedal disks of sea anemone for the first time and the Tyr1_Hl^Δ was successfully recombinant expressed. Our study will provide basis for future exploration of bio-adhesion mechanism and design of bio-adhesives derived from sea anemones.     

弧菌外膜蛋白Ompk基因序列分析及其多克隆抗体的制备

弧菌外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）OmpK不仅可激发机体的体液免疫和细胞免疫,而且可在不同血清型菌株之间产生免疫交叉反应。本研究利用克隆测序和查找GenBank获得20 株弧菌的Ompk基因序列并构建Ompk系统进化树,对比分析20 株弧菌Ompk基因序列;利用原核表达系统表达野生株Vibrio parahaemolyticus B的OmpK,纯化OmpK后制备兔多克隆抗体;采用酶联免疫吸附分析法和蛋白质印迹法（Western-blotting）分别检测抗体效价和特异性。系统进化树和基因序列比对结果显示Ompk基因在弧菌中高度保守,核苷酸序列相似性在77%以上;原核表达系统成功表达了弧菌OmpK,蛋白经纯化后成功制备的兔多抗效价达1∶16 000;Western-blotting实验证实抗体具有很好的特异性;OmpK多克隆抗体在弧菌中普遍存在免疫交叉性。因此,弧菌Ompk基因序列分析及其抗体研制,不仅为弧菌快速免疫学检测提供可能性,也为以OmpK为靶点的水产疫苗研制奠定了基础。     

一种重组融合抗菌肽ClavE-HD5的原核表达

根据海鞘Clavanins抗菌肽(ClavE)氨基酸序列和人HD5氨基酸序列,设计了一个融合的新抗菌肽ClavEHD5,通过PCR方法以大肠杆菌偏好密码子合成该融合重组肽的编码DNA,将该DNA克隆到大肠杆菌表达载体pET30α中,构建了ClavE-HD5的融合表达质粒。测序结果表明,克隆分子序列正确,可以表达1个12kDa的带标签融合蛋白。经转化大肠杆菌表达菌株E.coli Rosetta(DE3)后,以IPTG诱导并经Tricine-SDS-PAGE检测发现,凝胶中出现预期大小的多肽带,表明成功表达出重组的ClavE-HD5的融合抗菌肽。     

猪粪原料沼气工程系统中的原核微生物群落结构

采集了中国不同地区的13个猪粪原料沼气工程系统的沼液,利用16S rRNA基因扩增子高通量测序技术研究了原核微生物群落组成及多样性。结果表明,Firmicutes是猪粪原料沼气工程系统中的主导微生物,其次为Bacteroidetes、Proteobacteria和Chloroflexi。在相似的温度条件下,铵态氮与磷酸盐的比例是影响猪粪原料沼气工程系统原核微生物群落结构及多样性的主要因素。较高的铵磷比会富集Firmicutes门的菌群,尤其是Clostridium sensu stricto属;而较低的铵磷比则有利于Bacteroidetes和Proteobacteria。不同营养类型产甲烷菌对高浓度铵态氮耐受程度不同（氢营养型产甲烷菌 >Methanosarcina >Methanosaeta）,影响着产甲烷菌群落组成。产甲烷菌和互营菌的群落组成是影响沼气发酵产气效率的重要生物因素,高比例的氢型产甲烷菌和丙酸互营菌更有利于提高产甲烷效率。     

红色红曲菌组蛋白去乙酰化酶MrSir2的原核表达及活性分析

根据基因组序列信息,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)得到了红色红曲菌中组蛋白去乙酰化酶mrsir2基因的完整cDNA序列,其编码序列(coding sequence,CDS)为1539 bp,编码512个氨基酸,含有一个SIR2蛋白保守结构域。根据大肠杆菌的密码子的偏好性对mrsir2序列进行优化,优化后的序列与p ET-28b载体连接后转入宿主菌E.coli BL21中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。实验结果表明:在16℃条件下用终浓度为0.25 mM的IPTG诱导培养16 h后,目的蛋白Mr Sir2可溶性表达效果良好。Ni2+柱亲和层析纯化后的Mr Sir2重组蛋白在SDS-PAGE上显示为一条约75 ku大小的条带,蛋白定量浓度达1.97 mg/mL,经Western blot鉴定为目的蛋白,测定酶活为78.5(OD/min/mg),780μM的二氢香豆素(dihydrocoumarin,DHC)对Mr Sir2蛋白的酶活抑制率为47%。Mr Sir2蛋白的可溶性表达为全面了解其酶学特征提供了材料,也为体外分析蛋白相互作用奠定了基础。     

虾过敏原Troponin C (Pen m6)的克隆表达、免疫学鉴定及生物信息学分析

目的对斑节对虾(Penaeus monodon)第6组过敏原(Pen m6),肌钙蛋白C(Troponin C)进行克隆表达、免疫学鉴定并研究其生物学意义。方法提取斑节对虾总RNA;根据Gen Bank:HM034316.1设计引物及构建表达载体PET-24a-Pen m6;转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达;纯化后的重组Pen m6用Western bolt来鉴定免疫学特性;用生物信息学相关工具对Pen m6进行同源性分析,并预测其蛋白质的结构和功能。结果克隆出斑节对虾Pen m6基因开放阅读框453 bp,编码150个氨基酸。重组Pen m6蛋白呈可溶性,分子量约35kDa,能够与斑节对虾过敏患者血清IgE结合。斑节对虾与凡纳滨对虾亲缘关系比较近,其中斑节对虾Pen m6蛋白与凡纳滨对虾Troponin C1(gb|AET36896.1|)同源性为98%。理化性质预测Pen m6蛋白质不稳定。蛋白质结构预测结果显示Pen m6的结构主要以α螺旋组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(15~23、35~43、91~99、112~120)。B细胞抗原表位预测得到4个肽序列(7~16、21~30、28~37、58~67)。结论克隆的重组斑节对虾Pen m6蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究斑节对虾过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。     

肺炎克雷伯菌CRP蛋白表达与纯化及生物学特征分析

目的:原核表达获得肺炎克雷伯菌KP1_RS23625基因(crp)编码的CRP蛋白,并解析CRP蛋白具体的生物学功能.方法:首先克隆肺炎克雷伯菌crp基因,并亚克隆至pET-28a(+)质粒构建重组蛋白表达载体;然后体外原核诱导表达、纯化目的蛋白并进行SDS-PAGE电泳分析.进一步通过生物学信息方法分析CRP蛋白的生...