中国狂犬病毒疫苗株CTN-1-V三个代次的GP基因序列分析

目的分析三个代次CTN-1-V病毒株糖蛋白(GP)基因部分序列,并与代表性街毒株进行比较。方法利用RTPCR反应,从感染了CTN-1-V病毒的小鼠脑内获得GPcDNA的部分片段,并进行序列测定。结果三个代次的CTN-1-V病毒株GPcDNA序列的690个核苷酸与代表性狂犬病毒GP核苷酸相应序列同源性为83.2%～96.8%,氨基酸序列同源性为90.0%～97.4%。CTN1V株三代之间的核苷酸序列几乎相同。结论CTN1V株在传代过程中GP基因结构基本稳定,与中国流行的代表性街毒株的同源性高于aG株和PV株。     

体外传代选择对鼠衣原体质粒缺失株培养特性的影响

目的探讨传代选择对鼠衣原体质粒缺失株CMUT3菌株培养特性的影响及其相应机制。方法采用"无辅助感染"和"辅助感染"交替方式体外传代培养CMUT3菌株,而后观察传代菌株和亲代感染细胞时的吸附效率以及对离心因素的依赖性,并利用下一代测序技术对传代菌株CMUT3G40和亲代CMUT3G0进行全基因组测序分析。结果传代菌株CMUT3G40在感染He La细胞时对离心因素依赖性降低,吸附试验表明CMUT3G40菌株对细胞的吸附能力增强;比较基因组学分析结果表明CMUT3G40菌株与亲代CMUT3G0在tc0237基因存在差异,TC0237Q117E错义突变出现于CMUT3G40菌株基因组(CMUT3G40,99.7%;CMUT3G0,0%)。结论通过体外传代培养CMUT3菌株可获得吸附能力增强的菌株,该表型与传代选择所致的TC0237Q117E密切相关。     

人呼吸道合胞病毒适应株筛选及其生物学特性

目的建立在Vero细胞上低温传代的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)适应株,并分析其生物学特性。方法从155份肺炎儿童痰样中经PCR、测序鉴定出14株RSV,将其在Vero细胞上37℃传代第1次收获的病毒记为野毒株(wild-type,WT),通过逐步降低培养温度的方法在Vero细胞传代获得1株适应株(adapted-strain,AS)KM516-AS。将RSV适应株感染A549细胞后,分别至37、25、32和39℃培养,测定其冷适应性和温度敏感性。分别将RSV适应株及其对应的野毒株KM516-WT经鼻腔免疫小鼠,于免疫后第8天,取肺组织制作病理切片,显微镜下观察病变程度;取鼻甲和右肺匀浆组织,制备上、下呼吸道匀浆液,测定上、下呼吸道病毒滴度;于免疫后第13天,经小鼠尾部静脉采血,分离血清,于免疫后第14天,取肺组织制备匀浆液,采用ELISA法测定总抗体滴度,病毒中和试验法测定中和抗体滴度。结果 RSV野毒株KM516-WT的适应温度范围较广,4个不同温度下的病毒滴度变化不大;RSV适应株KM516-AS的适应温度范围较窄,25℃时的病毒滴度最高,随着温度的升高,病毒滴度逐渐降低,且仅有温度敏感性而无冷适应性。野毒株组小鼠肺部呈暗褐色,无严重的实质化,且肺泡和毛细血管中有明显的淋巴浸润;适应株组小鼠肺泡和毛细血管中淋巴浸润较少。适应株在体内的复制水平低于野毒株,并同野毒株一样具有较好的免疫原性。结论获得1株RSV适应株,并具有一定的减毒效果。     

MDCK细胞库的建立、检定及其生物学特性

目的建立MDCK细胞的主细胞库及工作细胞库,并进行检定,同时评价其生物学特性。方法从欧洲细胞保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Culture,ECACC)引进1株MDCK细胞,经传代扩大培养后,分别建立主库及工作细胞库。按照《中国药典》三部(2015版)规定的方法对细胞库进行细胞活力、细胞形态、无菌、支原体及细胞内外源病毒因子检查,并对细胞生长状况、传代稳定性、流感病毒敏感性进行检测。结果建立的MDCK细胞主种子库及工作种子库细胞形态呈不规则的上皮样细胞状,生长状态良好,细胞活率分别为96.0%和95.5%,无菌、支原体及细胞内外源病毒因子检查结果均合格。MDCK细胞生长曲线均呈S型,培养48~96 h进入对数生长期,随后进入平台期。连续传10代48 h细胞活率在93.0%~95.5%之间,较稳定。MDCK细胞对流感病毒较敏感,对B型流感病毒的敏感性高于A型流感病毒。结论建立的主细胞库及工作细胞库各项检测结果均符合《中国药典》规定,具有良好的传代稳定性及流感病毒敏感性。     

产黄青霉克隆VHb基因后的工艺

对克隆了VHb基因的产黄青霉进行了传代稳定性研究,实验表明克隆VHb基因后的产黄青霉遗传稳定性可满足发酵生产的要求,同时探索了最佳的摇瓶工艺条件,在新工艺条件下发酵产量可提高11%,通气量大幅下降.     

流行性乙型脑炎病毒在二倍体细胞上的适应性

目的研究流行性乙型脑炎病毒在二倍体(2BS)细胞上的传代适应性,确定在2BS细胞上培养乙脑病毒的条件和方法。方法通过病毒毒力和免疫原性检测,观察在不同培养条件下乙脑病毒在2BS细胞上的增殖情况。结果pH值在7·4～7·6之间、人血白蛋白含量为0·2%、病毒稀释度为1:1000时,病毒维持液培养的病毒滴度最高。在2BS细胞上传50代的病毒滴度均在7·0logLD50以上,且差异无显著意义。连续传代后病毒的免疫原性下降。结论建议用于建立病毒种子库的流行性乙型脑炎病毒,在2BS细胞上传代不应超过3代。     

传代鲜酵母取代活性干酵母发酵苹果酒的研究

从酿酒活性干酵母中筛选优势菌株,待其纯化扩培后形成鲜酵母液,以浓缩苹果汁(可溶性固形物调至18%)为底物进行苹果酒传代发酵,再进行苹果醋发酵和苹果醋饮料调配。结果表明:各传代优势酵母产酒率均稍高于活性干酵母。此外,其发酵的苹果醋总酸以及苹果醋饮料感官评价与活性干酵母无显著差异。     

灭活病毒诱导牙鲆传代细胞差减cDNA文库的构建及分析

以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR扩增后,取正向差减的PCR产物与T载体连接,构建抑制差减cDNA文库,随机挑取7400余个克隆,对其中4200多个克隆进行PCR扩增鉴定,发现近4000个克隆中均含有插入片段,大小在250～1000bps之间,进一步对含有插入片段的近4000个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因。     

流感病毒在Vero细胞上的适应性

目的研究WHO指定流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上的适应性,为用Vero细胞制备流感疫苗奠定基础。方法优化不同培养基、胰酶浓度、pH值等培养病毒的条件及收毒时间,将流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,并进行血凝效价检测及RT-PCR分析。结果在病毒维持液为F12+DMEM、pH为7.5、胰酶含量为1.5μg/ml、培养3 d收获病毒时,可获得较高的病毒血凝效价,连续传4代,病毒血凝效价降为0,RT-PCR检测结果为阴性。结论WHO推荐的流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,病毒血凝效价逐渐降低。     

福建霞浦海区刺激隐核虫虫株鉴定及生活史观察

分离患"白点病"的大黄鱼(Pseudosciaena crocea)鱼鳃上的刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans),提取基因组DNA,PCR扩增rDNA-ITS-1基因并进行序列分析.结果显示:该虫的rDNA-ITS-1序列与刺激隐核虫PYH4.12株及Chiayi虫株完全一致,表明福建霞浦流行的"白点病"病原为刺激隐核虫PYH4.12株或Chiayi株.以褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)为宿主,建立了该虫株的传代体系,对其生活史进行了详尽的观察,并收集各期虫体,为构建基因文库、功能基因的鉴定和分析奠定基础.