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目的制备对人肝癌细胞具有特异性杀伤活性的抗肝癌重组免疫毒素。方法利用大肠杆菌系统表达抗肝癌hdsFvhEDN基因重组免疫毒素。表达产物经NiNTA亲和层析纯化后,进行特异性杀伤活性检测。结果抗肝癌hdsFvhEDN重组免疫毒素以可溶性形式表达于大肠杆菌培养上清中,并获得有效纯化。ELISA法检测证实其具有与相应抗原特异性结合的活性。细胞毒试验表明对肝癌细胞具有杀伤作用,而对正常肝细胞无损伤。结论已成功地制备了具有特异性结合和杀伤活性的抗肝癌hdsFvhEDN基因重组免疫毒素,为其进一步应用奠定基础。 相似文献
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目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)、Rosettablue(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达产物经亲和层析纯化后,检测其细胞毒性。结果重组表达质粒pET-28a-hIL6(T22)-PE38经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组毒素相对分子质量约56 000,在大肠杆菌Rosettablue(DE3)中表达量最高。最适诱导表达条件为:1 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h。重组毒素能选择性地杀伤人骨髓瘤细胞U266和鼠骨髓瘤细胞SP2/0,体外对U266和SP2/0细胞的IC50分别为0.5~1.0和1.0~1.5μg/ml。结论重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中成功获得可溶性表达,纯化的蛋白可明显选择性杀伤U266和SP2/0细胞。 相似文献
3.
目的构建蜂毒肽(Melittin)与变构hIL-2融合基因原核表达质粒,并检测表达的融合蛋白对宿主菌E.coli生长的影响。方法以质粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)为模板,通过PCR定点诱变为Melittin-IL-2(88Arg,125Ala),将PCR产物和pET-15b载体分别经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE及ELISA分析表达产物;检测诱导不同时间重组菌的A600值,绘制生长曲线,并进行活菌计数。结果PCR扩增的目的片段长542bp,重组表达质粒测序分析证明目的基因如预期突变;ELISA可检测到目的蛋白表达,但表达量较低;SDS-PAGE分析未见目的条带;诱导表达4h,重组菌A600值由0.8下降至0.6;诱导2h,活菌计数由108个/ml降至104个/ml。结论已成功构建了原核表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),表达的融合蛋白可能对宿主菌具有毒性,从而杀伤宿主菌。 相似文献
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目的 诱导特异性免疫无反应, 防止器官移植排斥反应。方法 供者(NIH 小鼠)主要组织相容性抗原(H-2 Ag)与天花粉毒素(TCS)经异型双功能试剂SPDP、2-IT 交联, 制备免疫毒素(AG-TCS);AG-TCS 预处理受者(SD 大鼠), 体外观察其脾细胞对供者抗原再刺激的反应。结果 受者脾细胞对供者抗原再刺激呈抑制状态, 而对非特异性刺激(PHA)呈增生活跃。结论 AG-TCS 诱导的免疫无反应性具有供者特异性, 可用于器官移植免疫耐受的诱导。 相似文献
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为建立测定FTB的IC-ELISA方法,用复合抗原FTBS-BSA和FTBS-HSA作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与鼠SP2/O-Ag14骨髓瘤细胞融合,经反复筛选,获得2株稳定分泌抗FTB抗体的单克隆杂交瘤细胞株。免疫球蛋白亚型鉴定,1株为IgM,1株为IgG1。两株杂交瘤腹水的ELISA效价分别为1×10-6和1×10-8,用PEG沉淀法和辛酸-饱和硫酸铵法对抗体腹水进行了纯化,并分别测定了2种单抗与FTBS-IgG的亲和力常数以及与其它11种真菌毒素的相对交叉反应,建立了测定FTB的IC-ELISA法。 相似文献
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为建立FTB的间接酶联免疫吸附方法,用自行制备的FTBS-载体蛋白结合物FTBS-BSA和FTBS-HSA作为免疫原,按常规免疫程序分别免疫新西兰大耳白家兔各2只,4~10周后获得2种抗FTB的多克隆抗体,PcAb-FTB1(以FTBS-BSA为免疫原)和PcAb-FTB2(以FTBS-HSA为免疫原)。以FTBS-IgG作为标识抗原包被酶标板,建立了测定FTB的间接酶联免疫吸附试验(IC-ELISA)方法,这2株多克隆抗体与8种真菌毒素的交叉反应均较小。 相似文献
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目的优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量。方法采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性。结果确定最适自诱导培养条件为装瓶量20 ml/250 ml、接种量2%,28℃诱导25 h;最适自诱导培养基组分为:蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05%、甘露醇1%、乳糖0.6%、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87%提高至98%。结论优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考。 相似文献
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目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素。方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coliBL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Westernblot分析其抗原性。结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF。SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体。纯化后纯度达90%以上。Westernblot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性。结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素。 相似文献
10.
免疫毒素研究及临床应用进展 (一)临床前研究 总被引:2,自引:0,他引:2
李俊植 《中国生物制品学杂志》2004,17(1):60-63
免疫毒素和 /或融合蛋白毒素 ,是用化学方法或基因工程方法将肿瘤选择性配体与经修饰的多肽毒素共价连接而成的肿瘤治疗药物。这种药物是通过抑制肿瘤细胞蛋白质合成和诱导细胞凋亡而达到杀伤肿瘤细胞的目的。二十多年来 ,人们已进行了很多临床试验 ,但在药理学及毒理学方面的诸多问题尚未得到解决。令人兴奋的是 ,美国FDA首次批准了ONTAK(DAB389 IL2 )用于治疗人皮肤T细胞淋巴瘤 ,还有很多正在进行I/II期临床试验的其它靶向药物 ,均已呈现出显著的抗肿瘤作用 ,预期这些药物在未来的十年将得到更长足的发展。 相似文献