人伤寒减毒疫苗株及其用以表达外源抗原开发新一代疫苗应考虑的要点

本文一方面介绍伤寒减毒突变株Ty21a及其疫苗的生物学特征,进一步研究伤寒减毒活疫苗的策略以及研究进展情况;另一方面提出了利用伤寒减毒株表达外源抗原开发新一代疫苗应考虑的要点。     

我国云南登革4型病毒减毒株生物学特性及全基因组序列分析

目的对我国云南登革4型病毒分离株(Ban18)及其减毒株(Ban18 HK20和Ban18 HK30)的生物学特性进行分析,测定原株和减毒株的全基因组序列并进行比对,分析与毒力相关的位点。方法将各毒株在Vero细胞传代后进行空斑形态观察、小鼠脑内致病力和免疫原性检测;减毒株经空斑纯化后,挑选单克隆,检测其小鼠脑内致病力;提取减毒株基因组RNA,RT-PCR法分段扩增其全基因组序列并测序,应用DNAStar软件包进行序列比对分析。结果 Ban18 HK20和Ban18 HK30毒株在Vero细胞上形成的空斑较其原株稍大,但边界较模糊;两个代次的减毒株对KM小鼠不致病,对2~4日龄乳鼠的脑内致病力也明显低于其原株;Ban18原株和Ban18 HK20毒株免疫的小鼠经3个剂量的国际标准株H241株脑内攻击后,均无死亡,但Ban18 HK30毒株与对照组相比,未显示出保护作用;Ban18 HK20毒株的9个克隆株中,3株对乳鼠的脑内致病力低于其他6株克隆株,Ban18 HK30毒株的5个克隆株对乳鼠的脑内致病力无明显差异;减毒株的两个代次病毒与其原株存在3个氨基酸[A→V(C-111)、I→T(E-155)、I→L(E-369)]和一个核苷酸[G→A(3’UTR-219)]的共同差异。结论通过原代地鼠肾细胞传代的两个代次(HK20和HK30)病毒对小鼠的脑内致病力明显减弱,其中Ban18 HK20免疫原性较好,并从空斑克隆中筛选出3株毒力较Ban18 HK20更低的克隆株;C-111、E-155、E-369和3’UTR-219突变与毒力减弱密切相关。     

乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在小鼠体内的动态分布

目的研究乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在小鼠体内的动态分布。方法将SA14-14-2株分别经脑内和皮下途径接种小鼠,采用BHK21细胞病毒蚀斑法检测接种后不同时间病毒在小鼠不同脏器中的分布。同时以不同稀释度的强毒株SA14为对照。结果SA14-14-2株经脑内感染小鼠后,除在脑组织中短时间检出病毒外,在其他组织中均未检出病毒;经皮下感染小鼠后,在任何组织中均未检出病毒。而强毒株SA14无论经脑内还是皮下途径感染小鼠,在各种脏器中均可检出病毒。结论SA14-14-2株经皮下感染小鼠后,病毒不能在体内复制,证明乙型脑炎病毒减毒活疫苗具有较好的安全性。     

乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞多次传代后病毒基因稳定性研究

目的 研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHKC)传代后E蛋白基因的稳定性。方法 将乙脑病毒(JEV)减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞上传至20代,分析第1代(JEVPHKCKC P1)、第5代(JEVPH-KCP5)、第10代(JEVPHKC P10)、第15代(JEVPHKC P15)、第20代(JEVPHK P20)的E蛋白基因的核苷酸序列,并与Genbank的乙脑病毒减毒株(D90195)比较。结果 RT-PCR扩增出的乙脑病毒减毒株E蛋白基因片段大小为1 500bp,与Genbank库中乙脑病毒弱毒株SA14-14-2核苷酸、氨基酸序列比较显示,JEVPHKC P1,P5,P10病毒与GenbankD90195 E蛋白核苷酸和氨基酸完全相同,P15,P20与E425位点核苷酸和E142位点的氨基酸有不同,同源性分别为99.93％和99.8％。结论 乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明了乙脑减毒活疫苗的安全性。     

柯萨奇病毒A组16型疫苗候选株减毒特性的分析

目的对柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)减毒活疫苗候选株进行初步分析,为CA16减毒活疫苗的研制奠定基础。方法将两株CA16疫苗候选株(KM168和KM154)进行低温连续传代减毒,对不同代次病毒进行减毒特性的分析。将候选株病毒收获液免疫ICR乳鼠(颅内注射)及ICR成鼠(腹腔注射),分别评价减毒疫苗候选株的毒力、免疫原性以及乳鼠作为减毒活疫苗残余毒力评价动物模型的可行性;对病毒进行VP1片段的测序,分析遗传稳定性。结果两个候选株经低温连续传代后,均具有稳定的生长特性及良好的免疫原性,感染性滴度均保持在约7.0 Lg CCID50/ml,免疫小鼠后抗体阳转率达100%,最高GMT约1∶30。乳鼠及成鼠感染病毒后,在大部分组织中能检测到CA16病毒;KM154株在第12代后未对乳鼠产生临床致病性及致死率,病理检测结果主要表现为少量炎性细胞集结,无明显组织损伤,随着传代增加,组织损伤明显减少。两个候选株经低温连续传代后,能保证VP1片段的遗传稳定性。结论低温连续传代可使CA16的毒力明显降低,有望筛选出减毒活疫苗的候选株;1~2日龄ICR乳鼠可以作为CA16减毒活疫苗的候选株毒力评价的动物模型。     

副猪嗜血杆菌EZ-Tn5转座子插入突变体库的构建及减毒株的筛选

[目的]获得副猪嗜血杆菌减毒株.[方法]应用转座子技术构建转座子插入突变体库,卡那抗性筛选阳性菌株,PCR扩增卡那特异片段去除假阳性,小鼠感染试验检测突变株毒力,并对获得的减毒株进行生物学特性检测.[结果]所获得减毒突变菌株具有与野毒株相似的增殖能力,传代后毒力稳定,遗传学特性稳定.[结论]该研究结果为进一步探讨HPS毒力因子、致病机制奠定了基础.     

乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代后病毒基因的变化

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)减毒株SA14-14-2的编码弱毒力基因变化与病毒毒力关系。方法乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代,检测各代病毒的生物学特性和病毒主要结构蛋白即E蛋白的基因序列,并与基因库中登录的JEV强毒株SA14和弱毒株的相应序列比较。结果JEVSA14-14-2在乳鼠脑内连续传代后,病毒的复制滴度增加,对小鼠的脑内毒力也有所增强,但仍低于其亲代强毒株SA14的水平。JEVSA14-14-2在乳鼠脑内传1代后,病毒E蛋白的基因序列未发生改变;传第2代时,E107位点氨基酸发生了变化;第3代开始,E138位点氨基酸出现了改变。其他个别位点氨基酸也发生变化,但无规律性。乙型脑炎病毒强弱毒株间发生变化的其余7个氨基酸未再发生改变。结论JEVSA14-14-2在乳鼠脑内传代过程中,E蛋白基因E107和E138位氨基酸是决定病毒毒力的关键氨基酸。其他非结构蛋白基因也可能与毒力有关。     

流行性乙型脑炎病毒减毒株at222的生物学特性

目的 分析乙型脑炎病毒减毒株ａｔ２２２生物学特性,并与亲代野生强毒株ＡＴ２１进行比较。方法 ａｔ２２２株和 ＡＴ３１株在伊蚊细胞Ｃ６／３６上繁殖,培养上清用作病毒液,在Ｖｅｒｏ细胞上以病毒蚀斑法测定病毒滴度,以 小鼠脑内感染法测定其神经毒力。结果ａｔ２２２株在蚊细胞上生长缀慢,但仍可达到与其亲代强毒株相似的滴度, 即ｌ０８ＰＦＵ／ｍｌ。在Ｖｅｒｏ细胞上形成蚀斑比其亲代野生强毒株ＡＴ３１明显小,脑内感染小鼠不致死,而ＡＤＩ株却表现 出了极强的神经毒力。结论 对乙型脑炎病毒减毒株出ａｔ２２２的生物学特性进行了全面分析,为研究和开发乙型脑炎 疫苗提供理论依据。     

应用减毒株和强毒株试制脊髓灰质炎灭活疫苗的比较

作者采用单层猴肾细胞,接种中Ⅲ_2 及 Leon 株毒种。收获后的病毒悬液经澄清过滤,超滤浓缩后用 Sepharose CL 6B 凝胶过滤,再用 DEAE-Sephadex A_(50)进行离子交换层析提纯。最后加1/4000福尔马林,放37℃水浴灭活13天,制成灭活疫苗。疫苗中残余牛血清均低于60ng/ml,D-Ag 含量中Ⅲ_2 为2316Du/ml,回收率为64%;Leon 株为2068Du/ml,回收率为71%。分别免疫家兔均产生相当高(1024～8192)的血清中和抗体。     

我国水痘-带状疱疹病毒VZV84-7减毒株基因特征研究

目的　建立水痘 带状疱疹病毒 (VZV)毒株的特异性鉴定方法 ,研究我国分离的VZV84 7减毒株(VZV84 7株 )基因特征。方法　利用PCR分别扩增VZV84 7株和Oka株R2和R5可变区基因 ,比较两者串联重复单位拷贝数 ;用PCR结合限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)分析VZV84 7株和Oka株基因的BglI、PstI酶切位点突变 ;并对gpI编码区基因进行序列分析。结果　VZV84 7株R2、R5区PCR产物分别为 4 2 5bp和 2 5 5bp ,对应的串联重复单位拷贝数分别为 7和 1;Oka株R2、R5区PCR产物分别为 4 2 5bp和 36 7bp ,对应的串联重复单位拷贝数分别为 7和 2。VZV84 7株基因存在PstI酶切位点 ,而Oka株无PstI酶切位点 ;两者均存在BglI酶切位点。基因序列分析显示 ,VZV84 7株与Oka株在gpI区存在 4个碱基差异 ,并导致 1个编码氨基酸不同 ,氨基酸序列同源性为99 8%。结论　所建立的PCR和PCR RFLP方法简便、特异 ;VZV84 7株的基因特征与Oka株存在一定差异 ,但两株之间gpI编码区氨基酸序列具有较高的同源性