中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选

目的获得高质量的中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白抗原。方法改造表达载体,以构建中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白基因带有筛选标记的真核细胞表达质粒,将所构建质粒转染真核细胞,用含有抗性的培养基筛选出能够高效、持续表达包膜蛋白的稳定表达细胞株。结果所构建的表达载体pVRPEnv转染细胞后可表达目的蛋白,并建立了稳定表达细胞系。结论获得了可以高效、持续稳定表达中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白的细胞株。     

亚洲西尼罗河病毒的系统发育及E蛋白分子进化特征分析

目的 分析亚洲区西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)的流行情况,探讨其系统发育和分子进化特征.方法 从NCBI数据库中分别获取亚洲区流行的WNV 全基因组序列和E 蛋白序列,进行比对和同源性分析后构建系统进化树,分析来自不同株型病毒的结构蛋白E 的核苷酸和氨基酸的突变率,进一步找出氨基酸的替代位点.结...     

包膜蛋白在痘苗病毒形态发生过程中作用的研究进展

痘苗病毒（vaccinia virus,VACV）是正痘病毒属（Orthopoxvirus）成员之一,具有正痘病毒的典型特征,可作为该种属的模式病毒应用于各类研究中。VACV基因组大小约为200 000 bp,包含1个高度保守的中心编码序列（central coding region sequence,CRS）区域,可编码病毒形态发生各时期的关键蛋白,其中与形态发生相关的主要包膜蛋白A13L、A17L、A27L、A28L和A36R在VACV形态发生过程中发挥重要作用。本文就包膜蛋白在VACV膜附着和膜融合、病毒粒子组装、成熟病毒粒子（intracellular mature virus,IMV）胞内运动、细胞外囊膜病毒（extracellular enveloped virus,EEV）在细胞间传播等形态发生过程中作用的研究进展作一综述,以期为进一步探讨VACV及其他正痘病毒[如猴痘病毒（monkeypox virus,MPXV）]的致病机理、研发抗病毒药物及有效预防病毒感染提供理论依据。     

甲醇诱导条件对登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区表达的影响

目的探讨甲醇诱导浓度和诱导时间对登革病毒(dengue virus,DENV)四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区(envelope domainⅢ,EDⅢ)表达的影响,以期实现该蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法采用不同浓度甲醇(0. 05%、0. 1%、0. 25%、0. 5%、0. 75%、1%、1. 5%、2%、2. 5%、3%、5%、7. 5%)诱导表达带His标签的DENV四型联合重组EDⅢ蛋白,分别诱导18、24、30、48、72 h,样品经Western blot检测。最佳条件下诱导表达的蛋白液经Ni-Agarose His亲和层析纯化后,进行10%SDS-PAGE检测。结果最佳甲醇诱导浓度为2. 5%,最佳甲醇诱导时间为72 h。纯化产物经10%SDS-PAGE检测,于相对分子质量约41 000处可见单一目的蛋白条带,纯度为99%。结论当甲醇浓度为2. 5%,诱导时间为72 h时,可实现DENV四型联合重组EDⅢ蛋白在毕赤酵母中的高效表达。     

埃博拉病毒包膜蛋白DNA表达质粒对小鼠中和抗体的诱导作用

目的探讨埃博拉病毒(Ebola virus)包膜蛋白GP DNA表达质粒对小鼠中和抗体的诱导作用。方法将质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-GP(全长GP)、pcDNA3.1-GPΔTM(去跨膜段的GP)和pcDNA3.1-GPΔMe(t去起始密码子的GP)分别经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清GP抗体滴度;Western blot法检测抗体的特异性;利用埃博拉假病毒感染293E细胞模型观察中和抗体对埃博拉假病毒的中和作用。结果全长的埃博拉病毒GP和去跨膜段的GP可诱导有效的免疫反应,且诱导生成的GP抗体特异性良好;GP抗血清可有效抑制埃博拉假病毒进入293E细胞。结论埃博拉病毒GP DNA表达质粒可诱导高滴度的中和抗体,并可有效中和埃博拉假病毒。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gC2蛋白在CHO细胞中的表达、纯化及其免疫活性

目的在CHO细胞中表达单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)Ⅱ型gC2蛋白,纯化后检测其免疫活性。方法利用ANTHEWIN等软件分析GenBank中HSVⅡ型gC2的氨基酸序列,筛选抗原表位富集、且亲水性较好的蛋白胞外区片段,选择真核和原核生物均偏爱的密码子,通过OptimumGene软件对基因进行序列优化,化学合成全新的基因序列HSV2-gC2,PCR扩增后,插入pMCE5载体,构建重组表达质粒pMCE5-gC2,转染至CHO细胞中进行真核表达。表达的重组gC2蛋白经亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将纯化的重组gC2蛋白分别于第0、2、4周经腹腔免疫小鼠,以免疫PBS作为对照,采用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFNγ(代表Th1细胞因子)和IL-4(代表Th2细胞因子)的细胞频率。结果重组表达质粒pMCE5-gC2经菌落PCR、双酶切(EcoRⅠ/NotⅠ)及测序证实构建正确;纯化的重组gC2蛋白相对分子质量约为90 000,纯度约为85%,浓度为40μg/ml,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;通过3次免疫,小鼠产生了高水平的血清抗体,与免疫前相比,差异均有统计学意义(P0.001);免疫小鼠脾细胞经特异性抗原刺激后,分泌IFNγ和IL-4的细胞频率分别为(13.46±2.832)/106和(19.2±2.48)/106个细胞,均显著高于对照组(P0.001)。结论在CHO细胞中表达了重组gC2蛋白,纯化的蛋白能够激发小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,为进一步研制HSV亚单位疫苗奠定了基础。