应用电镜原位分子杂交技术对腺病毒DNA在宿主细胞内进行定位

以Biotin标记的dATP(Bio-7-dATP)通过缺刻翻译(Nick Translation)制备腺病毒的基因组探针,建立了电镜原位杂交技术,并研究腺病毒感染的HeLa细胞内病毒DNA的分布。结果表明,免疫胶体金颗粒特异地标记在腺病毒感染的细胞核内,并且在核内呈区域性分布。整装抽提后的细胞原位杂交结果显示出,胶体金颗粒呈族状马串珠状结合在核骨架上,从而在形态学上证实了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系。     

溶瘤腺病毒与抗癌药物联合治疗肝肿瘤的可行性研究

通过抗肿瘤药物PHA-767491联合溶瘤腺病毒AdCN305-HcRed开展针对肝癌细胞系HepG2的杀伤效率研究.通过PHA-767491单独及其与AdCN305-HcRed联合共同杀伤肝癌细胞来探究细胞周期抑制性化疗药物与溶瘤腺病毒联合使用的可行性.细胞杀伤实验结果发现PHA-767491能抑制溶瘤腺病毒在肝肿瘤细胞HepG2内的增殖,从而影响溶瘤腺病毒的增殖溶瘤作用.结果表明:溶瘤腺病毒与抑制细胞周期的化疗药物联合在肝肿瘤中的应用需要慎重.     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.     

提高腺病毒对肿瘤细胞转染效率的药物效果评价

为了解决在肿瘤基因治疗中腺病毒载体介导的转染细胞效率低的问题,高效、低毒的转染试剂为其提供了一条新途径.采用正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-Dodecyl-β-D-Maltoside,DDM)、DC-Chol、SDS联合腺病毒e GFP-Ad转染肝癌细胞Hep G2、食管癌细胞EC109及人正常肝细胞L-02与食管正常细胞Het-1A,48 h后观察绿色荧光蛋白表达情况并计阳性细胞率,评价联合转染试剂处理提高e GFP-Ad转染肿瘤细胞的效率.实验结果表明,DDM(3μg/m L)、DC-Chol(1 000μg/m L)、SDS(0.5μg/m L)联合e GFP-Ad转染肿瘤细胞Hep G2和EC109的效率分别可达85%和78%、80%和76%、45%和41%,与单独e GFP-Ad相比,转染效率分别提高16倍和14.6倍、15倍和14.2倍、8倍和7.2倍;且与正常细胞相比,DDM能显著提高对肿瘤细胞的转染效率,二者差异具有高度统计学意义.作为非脂质体类试剂,DDM能显著提高腺病毒对肿瘤细胞的转染效率,为进一步提高腺病毒介导的肿瘤基因治疗提供有效方法与技术参考.     

流感疫苗主种子批毒种中外源性禽腺病毒Ⅲ型荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立流感疫苗主种子批毒种中外源性禽腺病毒Ⅲ型(egg drop syndrome virus,EDSV)的荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法针对EDSV六邻体蛋白保守区分别设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的线性、特异性、精密性、灵敏度及可行性。采用新建立的荧光定量PCR法对16株流感疫苗主种子批毒种进行外源性EDSV检测。结果该方法的最佳线性范围为1×10~4~1×10~9 copies/μl,回归曲线为y=-3.385 x+39.616,R~20.99;与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应;试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均2%;灵敏度为101 copies/μl;该方法检测P0代样品的最低检测限为10-6掺入体积比例,血清学方法检测P0~P3代样品的最低检测限为10~(-2)~10~(-3)掺入体积比例。该方法检测16株流感毒种中外源性EDSV的结果均为阴性,与血清学方法检测结果一致。结论成功建立了检测EDSV的荧光定量PCR法,提高了检测灵敏度和检测效率,更好地满足了流感疫苗应急检验中快检的要求。     

辐射诱导增强p53重组腺病毒转染对人结直肠癌细胞的抑制

探讨了辐射诱导对p53重组腺病毒载体转染p53突变型结直肠癌细胞(HT-29细胞系)的影响.以复制缺陷型重组腺病毒载体(AdCMV-GFP)为对照,用复制缺陷型p53重组腺病毒载体(AdCMV-p53)转染经0.5、1.0、2.0 Gy γ射线照射的HT-29细胞,用流式细胞分析法检测细胞凋亡和p53蛋白表达,并用克隆形成法测定细胞增殖能力.结果表明,0.5 Gy辐射诱导明显提高了AdCMV-p53转染对HT-29细胞的抑制,促进细胞凋亡.0.5Gy辐射诱导对AdCMV-p53转染HT-29细胞的抑制杀伤的增强作用最强,0.5 Gy辐射诱导及40 MOI和80 MOIAdCMV-p53转染对肿瘤的抑制率比同等剂量下单纯转染组分别提高约50%和20%,比0.5 Gy单纯辐照组提高40%.因此,0.5 Gy辐射诱导可有效增加低于80 MOI AdCMV-p53转染对HT-29细胞的抑制作用.辐射诱导AdCMV-p53转染HT-29细胞以最大辐射剂量不超过1.0 Gy及AdCMV-p53转染量低于80MOI为宜.     

重组腺病毒疫苗插入基因表达产物鉴别方法的建立及验证

目的 建立重组腺病毒疫苗插入基因表达产物的鉴别方法,并进行验证。方法 采用Western blot法对重组腺病毒感染后的细胞上清液进行检测,鉴别插入基因表达产物是否表达。对方法的专属性和耐用性进行验证,并采用该方法鉴别3批重组腺病毒疫苗样品插入基因表达产物的活性。结果 重组腺病毒疫苗插入基因表达产物能被黏蛋白1-生存素[mucin 1(MUC1)-Survivin]的两种抗体分别识别,在相对分子质量约37 000处可见特异性条带,大小和组成与实际值相符,方法的专属性和耐用性均符合要求。3批重组腺病毒疫苗插入基因表达产物也均能被MUC1-Survivin的两种抗体分别识别,在相对分子质量约37 000处可见特异性条带,而阴性对照不能被识别。结论 采用Western blot法检测插入基因表达产物的活性,专属性和耐用性均较好,适用于重组腺病毒疫苗产品的鉴别试验,可为疫苗制备过程中的质量控制及产品检定提供参考。     

经动脉灌注rAd- p53联合TAE治疗中晚期肝癌的疗效观察

【摘要】 目的 探讨经动脉灌注重组人p53腺病毒注射液联合碘化油栓塞治疗中晚期肝癌的安全性及有效性。方法 回顾性分析2012年5月至2015年6月采用经肿瘤供血动脉灌注重组人p53腺病毒注射液联合碘化油栓塞治疗的31例中晚期原发性肝癌患者的临床资料。所有入组患者均为无法行外科手术治疗的中晚期肝癌患者。患者介入术程顺利,术后采用改良实体瘤评价标准（mRECIST）评价临床疗效。采用SPSS 18.0软件进行统计分析。结果 31例患者共进行76次（平均每例2.4次）介入治疗。随访3～36个月,术后3、6、12个月完全缓解率（CR）均为0,部分缓解率分别为58.1%、38.7%、29%,总有效率分别为58.1%、38.7%、29%;6个月、1年及2年的总生存率分别为77.4%、58.1%、19.3%;6个月、1年及2年的无进展生存率分别为38.7%、25.8%、12.9%。全组患者均未见急性肝衰竭、肝脓肿、肺栓塞等严重并发症,术后87.1%患者出现发热。结论 采用经动脉灌注重组人p53腺病毒注射液联合TAE治疗中晚期肝癌具有良好的安全性和有效性,为中晚期肝癌提供了一种新的治疗选择。
     

表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶的重组腺病毒的构建及其免疫原性

目的构建表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的重组腺病毒,并检测其免疫原性。方法从质粒pMD19T-simple-NA中扩增NA基因,克隆至穿梭质粒pShuttleCMV中,经同源重组获得重组腺病毒质粒,转染Ad-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-NA,RT-PCR和免疫荧光法检测NA基因在Vero细胞中的转录和表达。CsCl密度梯度离心纯化重组腺病毒,免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗NA抗体滴度。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定表明带有目的基因的穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中;NA基因在Vero细胞中成功转录和表达;重组腺病毒可刺激小鼠产生抗NA抗体,初免后4周,抗体水平达最高,为1∶100 000。结论成功构建了表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白的重组腺病毒,其可刺激小鼠产生有效的免疫应答,为甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。