蜂毒肽/变构hIL-2融合蛋白的原核表达及其对宿主菌生长的影响

目的构建蜂毒肽(Melittin)与变构hIL-2融合基因原核表达质粒,并检测表达的融合蛋白对宿主菌E.coli生长的影响。方法以质粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)为模板,通过PCR定点诱变为Melittin-IL-2(88Arg,125Ala),将PCR产物和pET-15b载体分别经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE及ELISA分析表达产物;检测诱导不同时间重组菌的A600值,绘制生长曲线,并进行活菌计数。结果PCR扩增的目的片段长542bp,重组表达质粒测序分析证明目的基因如预期突变;ELISA可检测到目的蛋白表达,但表达量较低;SDS-PAGE分析未见目的条带;诱导表达4h,重组菌A600值由0.8下降至0.6;诱导2h,活菌计数由108个/ml降至104个/ml。结论已成功构建了原核表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),表达的融合蛋白可能对宿主菌具有毒性,从而杀伤宿主菌。     

蜂毒肽在大肠杆菌中的高效融合表达与纯化

生物法制备蜂毒肽是实现大量制备蜂毒肽的关键技术。为实现蜂毒肽的高效表达,通过化学法合成含信号肽、前导肽和成熟肽的蜂毒肽基因promet和蜂毒肽成熟肽基因met,与麦芽糖结合蛋白基因mbp连接,克隆到载体pET15-b,构建重组质粒pET-MBP-MET和pET-MBP-proMET。重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）,以0.1 mmol/L IPTG进行诱导,30 ℃下过夜诱导,融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。两种目标蛋白质经Ni柱和Dextrin Sepharose HP两步亲和纯化,得到了纯度达90%以上的融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET,培养1 L大肠杆菌菌液能制备约20 mg纯蛋白质。通过牛津杯抑菌实验发现,MBP-MET、MBP-proMET能明显抑制细菌生长,产生明显的抑菌圈,MBP-MET和MBP-proMET最低抑菌浓度（MIC）分别为100 μg/mL和140 μg/mL。本研究首次实现了蜂毒肽的高效表达,并进行了抑菌功能验证,为生物法制备蜂毒肽提供了高效、安全的合成途径。     

Promoting effect of ethanol on dewetting transition in the confined region of melittin tetramer

To study the influence of ethanol molecules on the melittin tetramer folding,we investigated the dewetting transition of the melittin tetramer immersed in pure water and 8%aqueous ethanol solution(mass fraction) by the molecular dynamics simulations.We found that the marked dewetting transitions occurred inside a nanoscale channel of the melittin tetramer both in pure water and in aqueous ethanol solution.Also,ethanol molecules promoted this dewetting transition.We attributed this promoting effect to ethanol molecules which prefer to locate at the liquidvapor interface and decrease the liquid-vapor surface energy.The results provide insight into the effect of ethanol on the water dewetting phenomena.     

蜂毒肽的分离纯化及结构鉴定

目的 对蜂毒肽进行分离纯化,并进行结构鉴定。方法 以意大利蜜蜂蜂毒为原料,经溶解、超声、浸提、过滤等,并制备C18液相色谱柱,对一次纯化采用的流动相、洗脱程序进行优化,对二次纯化时进样量、进样浓度进行选择,冻干后得到高纯度蜂毒肽。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)进行分子量测定等定性研究,利用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)进行二级结构表征,尝试利用低场核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技术对其氢谱定性解析,基于高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)的面积归一化法测定蜂毒肽纯度。结果...     

蜂毒肽与死亡素杂合肽(MT)在大肠杆菌中融合表达的研究

人工合成的蜂毒肽与死亡素的杂舍肽DNA序列，经聚合酶链式反应（PCR）扩增后得到带有BamHI和XhoI限制性酶切位点的序列．将此基因克隆至载体pET-32a，成功构建了重组质粒pET32a—MT．测序验证后转化大肠杆菌BL21（DE3），37℃IPTG诱导，获得高效表达，融合蛋白经Ni柱亲和纯化后用肠激酶切下杂合肽，杯碟法检验酶切产物具有抑菌活性。     

蜂毒中蜂毒肽的分离纯化

开发蜂毒中蜂毒肽的纯化工艺,以获得高纯度的蜂毒肽.采用离心、超滤等方式对粗蜂毒进行预处理,结合制备液相色谱技术,以聚苯乙烯微球为填料,对填料的型号、流动相、上样量进行考察.实验结果表明,以聚合物微球Ps20-300为填料,以含0.1％三氟乙酸的乙腈/水为流动相进行洗脱,当上样量为1.2％时,蜂毒肽的分离纯化效果较好.对优化的色谱条件进行放大制备,蜂毒肽纯度可达99.2％,纯化收率为58.9％.     

蜂毒的主要肽成分—蜂毒肽在癌症治疗中的应用

目的蜂毒肽是一种具有螺旋结构的两亲性多肽,具有抗炎、抗病毒、抗菌和降血压等作用。近年来,发现蜂毒肽应用于癌症治疗具有独特优势,作者对蜂毒肽的抗癌机制及其在药学领域中的应用进行总结。方法以国内外40篇文献为依据,综述了蜂毒肽的结构、抗肿瘤应用的机制及为了规避蜂毒肽溶血性问题、非特异性作用以及易被代谢降解等缺点的手段等。结果与结论蜂毒肽已被证明在多种癌症的临床前研究中有效,并可通过抗体结合、基因转染、纳米技术或与化疗药物协同给药等手段,增加蜂毒肽靶向性与特异性,解决其在肿瘤治疗中的问题。