二氢叶酸还原酶在盐溶液中的分子动力学模拟

为了研究嗜盐酶如何在高盐环境下维持稳定性与活性,本文以沃尔卡尼极嗜盐菌及大肠杆菌的二氢叶酸还原酶(DHFR)为模型,将二者分别置于5种不同盐浓度的水溶液中进行分子动力学模拟。经9ns动力学模拟,得到了二者在不同浓度盐溶液中的运动轨迹,通过对运动轨迹的分析,获取了二者在不同盐浓度下的动力学特性。结果发现嗜盐古生菌的二氢叶酸还原酶自身所形成盐桥及与溶剂所形成的氢键均比大肠杆菌的二氢叶酸还原酶多,而溶剂可及性表面则要小,二者差异均达极显著水平。同时还分析了这两种分子及其氨基酸残基的柔性等。     

通过核糖核苷酸还原酶M2逆转肝癌细胞对5-氟尿嘧啶耐药

目的：探讨核糖核苷酸还原酶M2（RRM2）在肝癌细胞对5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药中的作用,并开发潜在的策略来提高肝癌细胞对5-FU的敏感性。方法：利用Western blot检测5-FU耐药肝癌细胞（BEL/5-FU）与非耐药肝癌细胞（BEL7402）中RRM2蛋白的表达差异;通过用RNA干扰技术下调BEL/5-FU细胞中RRM2的表达或RRM2抑制剂3-AP（Triapine）抑制RRM2活性;CCK-8和集落形成实验用于检测细胞的增殖能力;使用高内涵细胞成像系统仪检测与分析细胞凋亡。结果：BEL/5-FU细胞中RRM2的表达量是BEL7402细胞的2.5倍。RNA干扰技术能够下调BEL/5-FU细胞中RRM2的表达,并使5-FU对BEL/5-FU细胞的半数抑制浓度（IC50）下降约50%,同时细胞集落形成能力也显著减弱。3-AP与5-FU联合处理BEL/5-FU细胞,使5-FU对BEL/5-FU细胞的IC50下降约40%,细胞集落形成能力减弱,并促进5-FU导致的细胞凋亡。结论：RRM2与肝癌细胞对5-FU的耐药相关,本研究通过抑制RRM2的活性来逆转肝癌细胞对5-FU的耐药,为提高肝癌的5-FU化疗疗效提供新靶点和新思路。     

5-芳亚甲基-N-(4-羧基苯基)罗丹宁衍生物的微波辅助合成及分子模拟研究

以对氨基苯甲酸为原料,采用简易方法合成N-(4-羧基苯基)罗丹宁,并在醋酸和醋酸钠体系中与芳香醛化合物经回流反应或微波辐射合成(Knoevenagel缩合)得到系列标题化合物,并用Sybyl-X 2.0程序研究了标题化合物与烯酰基载体蛋白(ACP)还原酶的分子对接情况。     

新型还原酶的挖掘与设计及手性醇的制备

为了解决生物催化制备手性化合物用催化剂需求的不足、还原酶催化过程存在酶活性低和底物浓度限制的问题。基于基因挖掘技术和还原酶保守序列分析,经筛选和设计获得了新型还原酶SDR05;采用单因素实验和Box-Behnken法,构建了表达还原酶SDR05的重组菌不对称还原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮(BTAP)制备相应手性醇的反应体系。结果表明,重组菌在以体积分数为69%异丙醇、3.9 mmol·L^-1氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)、1mmol·L^-1MgCl₂、300 g·L^-1重组菌、3 000 mmol·L^-1 BTAP和pH为7.4磷酸缓冲液组成的反应体系和32℃、150 r·min^-1条件下催化反应18 h,产物产率和对映体过量值分别为98.3%和99.9%。研究结果丰富了还原酶库,实现BTAP底物在高质量浓度下的转化,为工业化制备(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇等手性化合物奠定基础。     

牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶的分离及其酶学性质

以冷鲜牛背最长肌为原料,采用硫酸铵盐析、超滤法对原料肉中的高铁肌红蛋白还原酶进行粗分离,并研究温度、pH、金属离子对高铁肌红蛋白还原酶活性的影响.结果表明:在硫酸铵饱和度65％,超滤(＞50 kDa)条件下,牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶可得到分离与纯化.试验范围内,牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶的分子量为29.0～66....     

木糖还原酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的定向整合

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的乙醇生产菌株,但因缺少戊糖代谢途径而不能利用木糖,为了改良工业酿酒酵母利用半纤维素发酵生产乙醇的性能,利用分子生物学技术构建能够利用木糖的基因工程酵母。选取酿酒酵母染色体的rDNA重复序列作为外源基因整合位点,依此构建多拷贝染色体整合型载体pUG-LR。采用融合表达策略扩增得到含有酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子PADH和树干毕赤酵母木糖还原酶基因xyl1的融合序列,并将其插入pUG-LR载体中,构建成含遗传霉素G418抗性标记的同源重组质粒pUG-LR-XYL1。以工业酿酒酵母ZU-01为宿主,通过优化后的电穿孔法将重组质粒导入经缓冲液处理的酵母细胞,30℃培养。通过提高YEPX复筛培养基G418浓度,得到10株生长较快的优良性状转化子。在不含G418的YEPX培养基上传代8次以上,以转化子基因组DNA为模板,进行PCR检测,均可获得目的基因片段。研究结果表明:木糖还原酶基因xyl1已定向整合于ZU-01染色体DNA上并稳定遗传,为后续构建工业酿酒酵母的木糖代谢通路、利用木糖产酒精的重组菌株奠定了基础。     

重组酿酒酵母生物合成菜油甾醇

菜油甾醇作为甾体药物（孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等）的重要合成前体已受到国内外研究学者的广泛关注。首先通过生物信息学分析,筛选了10种不同来源的7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7,并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）内源的ERG5基因替换成不同来源的DHCR7基因,构建了菜油甾醇合成菌株。结果发现整合来源于Pangasianodon hypophthalmus DHCR7的菌株Zw507表现出最高的菜油甾醇的产量216.93 mg/L。进一步筛选了10种酵母内源启动强度较强的启动子来与PhDHCR7基因进行组合,结果显示以TEF1p为启动子时菜油甾醇的产量最高可达253.35 mg/L。为了进一步提高菜油甾醇产量,增加了DHCR7表达盒在酵母基因组上的拷贝数。当拷贝数为3个时,菜油甾醇的产量达到最高302.27 mg/L。最终,通过5 L发酵罐进行补料分批发酵,实现了916.88 mg/L菜油甾醇产量。该菌株可作为后续甾体药物生物合成的优良底盘细胞。     

托盘和真空包装对冷却猪肉中MetMb还原活性的影响

在冷却肉的贮藏过程中,其肌红蛋白(Mb)被氧化为高铁肌红蛋白(MetMb),导致了冷却肉的褐变。研究了托盘包装和真空包装条件下,冷却肉自身的还原系统活性变化规律及其对肉色稳定性的影响。在2周的贮藏期内,真空与托盘包装冷却肉糜肌浆蛋白粗提液的还原活性持续下降;但真空包装组MetMb还原酶粗提液还原活力第1天到第14天活性差异不显著,托盘包装组前后差异显著。真空包装组在贮藏期间MetMb含量持续下降,但托盘包装组MetMb含量则持续上升,说明无氧条件有利于MetMb的还原。托盘包装组TBA在贮藏期间持续上生,但真空包装组TBA变化不明显。结果表明,托盘包装不利于冷却肉自身MetMb还原能力的维持,而真空包装的无氧环境,有利于MetMb的还原和肉色的保持。     

大蒜对莴笋乳酸发酵中亚硝酸盐形成的抑制作用

在盐水中添加蒜汁进行莴笋乳酸发酵,与不加蒜汁相比,大蒜可以极明显地抑制亚硝酸盐的形成,避免“亚硝峰”的出现,抑制率达98%以上。添加蒜汁还可以增进产品感官质量,促进发酵进程。发酵前,对原料进行80℃、3分钟热烫,可减少硝酸盐、亚硝酸盐的含量,使硝酸盐还原酶失活。产品贮藏后,硝酸盐、亚硝酸盐的含量减少。     

人源细胞色素P450 2E1与细胞色素P450氧化还原酶的共表达

目的利用大肠埃希菌(E.coli)表达系统异源表达细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1),并与细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P450 oxidoreductase,POR)实现共表达,使其具有代谢活性,为药物代谢的研究提供单一性的酶源。方法以人肝组织RNA为模板,RT-PCR扩增CYP2E1基因,插入pCW空载体,构建重组表达质粒pCW-2E1,转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定;利用双启动子原理构建CYP2E1与POR共表达的重组质粒pCW-2E1-POR,采用对氨基苯酚法检测CYP2E1重组酶的代谢活性,并对不同培养时间(18、28、38 h)的代谢活性进行比较。结果质粒pCW-2E1经PCR鉴定,证明构建正确;表达的重组人CYP2E1蛋白相对分子质量约56 000,主要以可溶性形式表达。质粒pCW-2E1-POR经PCR及酶切鉴定,证明构建正确;导入质粒pCW-2E1-POR的重组菌提取的蛋白样品具有明显的代谢活性,培养18、28、38 h后,代谢活性均值分别为(0.195±0.004)、(0.189±0.003)和(0.192±0.004)nmol/(min·mg),差异无统计学意义(P0.05),但与导入质粒pCW-2E1的重组菌提取的蛋白样品的代谢活性相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建了具有代谢活性的CYP2E1重组酶,且3个培养时间段之间的代谢活性无明显差异。