Protoplast from <Emphasis Type="Italic">β</Emphasis>-carotene-producing fungus <Emphasis Type="Italic">Blakeslea trispora</Emphasis>: Preparation,regeneration and validation

The effects of key parameters on the preparation and regeneration of protoplast from the β-carotene-producing fungus Blakeslea trispora were discussed in this paper, including the combination of various enzymes, mycelial age, digesting time and temperature, pH value, osmotic stabilizers, pretreatment, culture medium and culture method. Under the condition of mixed enzymes in osmotic stabilizer (0.6 M NaCl) combined with 2% lysozyme, 3% cellulase and 3% snailase, the highest protoplast yield, as high as 7.48×106 protoplasts/mL, was obtained when mycelial age was 60 h at pH 5.0–6.0 with digesting for 14–16 h at 28 °C. After purification of the obtained protoplasts, they were regenerated in PDA regenerative medium using bilayer plate culture method. To validate the usability of the protoplasts, a novel plasmid with green fluorescent protein (GFP) was used in transformation for easy visual observation. The results showed that the protoplasts prepared by the optimized method were active and applicable in further gene manipulation experiments. This work was presented at 13 ^th YABEC symposium held at Seoul, Korea, October 20–22, 2007.     

茂原链霉菌原生质体制备条件的优化

对茂原轮枝链霉菌(Streptoverticilluim mobaraense)的原生质体制备进行了研究.研究表明在培养基中加入4%的甘氨酸有利于原生质体的释放.茂原轮枝链霉菌孢子悬液在41 ℃下用2.5 mg/mL溶菌酶作用4 h的效果最好,原生质体形成率与再生率的乘积可达24%.     

提高衣康酸发酵产量的一种方法-原生质体融合

为了提高衣康酸发酵产量,我们制备了衣康酸土曲霉原生质体和柠檬酸黑曲霉原生质体,并进行了融合,以融合子为起点,进行诱变和筛选.实验结果表明,这种方法既简易又有效.     

氨基酸产生菌融合子产量分布的研究

谷氨酸产生菌钝齿棒杆菌T~(s-Li)(Leu~-Ile~-Str~rRif~r)与北京棒杆菌7338(野生型Str~sRif~s)融合子(A组)及谷氨酸产生菌钝齿棒杆菌T_(6-13)。(野生型Str~sEry~s)与赖氨酸产生菌黄色短杆菌2—1(Met~-Thr~-Str~rEry~r)融合子(B组)在谷氨酸产量分布上明显地向正变与负变方向移动,分别形成两个峰值,保持原株产酸量的融合子只占总数的4％和2％。A组正变频率为72.7％,远高于B组的27.5％,谷氨酸最大增加幅度为64.3％。B组的赖氨酸产量分布与谷氯酸产量分布不同,负变率达到93.1％。这可能与融合过程中营养互补有关。     

甜菜原生质体培养技术的研究：（1）子叶原生质机分离及愈伤组织形成

取生长在26℃、光照强度3000lux、14h光照/日条件下的14日苗龄甜菜子叶,用2.0％Cellulase Onozuka K-10+1.0％ Macerozyme Onozuka R-10+0.5％ Driselase+CPW9M酶液酶解。原生质培养在改良MS+2.4-D1.5mg/L+IAA 0.5mg/L+6BA0.5mg/L培养基中液体浅层培养。培养第7～10天时,先后发生第一和第二次细胞分裂,此后细胞继续增殖形成细胞团,约40天时,形成微愈伤组织。     

酿酒葡萄悬浮细胞游离原生质体

酿酒葡萄花丝在含６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ、２，４－Ｄ１ｍｇ／Ｌ的Ｂ５培养基上诱导出胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在含有２，４－Ｄ０．５ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０．０１ｍｇ／Ｌ的Ｂ５液体培养基中振荡培养，得到细胞悬浮系。悬浮细胞在含ＣｅｌｕｌａｓｅＲｓ２％、ＰｅｃｔｏｌｙａｓｅＹ２３０．３％、５ｍＭＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、０．６Ｍ甘露醇，ｐＨ５．６－５．８的酶液中游离得到原生质体。     

原生质体紫外诱变筛选还原双乙酰能力强的啤酒酵母

实验采用原生质体紫外诱变方法，对啤酒酵母进行处理，然后用双乙酰梯度板检测突变株还原双乙酰能力，通过实验室摇瓶发酵，得到一株还原双乙酰能力强的菌株。     

细菌的原生质体融合

本文评论了有关细菌原生质体融合研究的进展,并报道了作者的部分研完工作。本文较充分讨论了原生质体融合的基本枝术步骤,包括出发株的选择,原生质体的制备,融合,再生,筛选和特性验证。介绍并推荐以育种为目的的该技术的较适使用条件。     

利用单灭活原生质体融合技术选育降酸能力强的葡萄酒酵母

目的:选育既有较好的发酵性能,又有较强的降酸能力的葡萄酒酵母菌种用于葡萄酒的生产。方法:通过发酵性能好的长城葡萄酒酵母单倍体L13(Lys-)(赖氨酸缺陷型)的原生质体与灭活的降酸能力强的粟酒裂殖酵母1685(Ino-)(肌醇缺陷型)的原生质体进行融合实验,然后通过传代稳定性、降酸鉴定及发酵实验,选育既有较好的发酵性能,又有较强的降酸能力的葡萄酒酵母菌种。结果:得到28株融合子,融合率为6.8×10-7,最终获得了1株传代稳定的融合子G8,降酸率为30.4%。结论:利用单灭活原生质体融合技术,选育出1株发酵力强、降酸性能好葡萄酒酵母菌株。     

甜菜原生质体培养及大块愈伤组织的产生

将发芽盒内培养2－3周的甜菜子叶,在CPW12M高渗溶液中预质壁分离4h 后用2％CellulaseOnozukK-10 0.5%Macerozyme 0.5%Driselase CPW9M酶液酶解12h。原生质体在K8P＋2．4－D2．0mg／L＋6－BA0．5mg／L培养基中液体浅层培养。6周内形成大量的多细胞团和微愈伤组织,进一步培养,形成直径为0．5cm左右松散的大块愈伤组织。