天花粉蛋白突变体TCS_(KR173-174CG)的构建、表达与纯化

目的构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模板,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Ni-NTA层析纯化。结果目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论已成功构建了TCS突变体基因,并获得高效表达。     

Using Xe as a heavy atom for phase determination of protein trichosanthin structure

Under gas pressures of 1–3 MPa, xenon can be bound to discrete sites in hydrophobic cavities of protein,so as to use Xe as a heavy atom for determining phases in protein crystallography. Using single anomalous scattering diffraction method, we demonstrate that an interpretable electron density map can be obtained for protein trichosanthin from a single xenon derivative. We found, for the first time, a pre-existing hydrophobic cavity just under the protein surface of trichosanthin.     

天花粉蛋白的定点突变及聚乙二醇修饰

目的对天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)进行定点突变及聚乙二醇(PEG)修饰,并对修饰产物进行DNA酶活性分析。方法选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83和KR173-174)进行定点突变,将所构建的两个突变体(TCSYFF81-83ACS和TCSKR173-174CG)在大肠杆菌中表达,并纯化表达产物。通过第82位和173位引入的半胱氨酸残基,分别对突变体蛋白进行PEG定点修饰。通过与突变型TCS比较,分析两个PEG修饰型TCS的DNA酶活性。结果突变的TCS经酶切鉴定及测序分析,证明质粒构建正确,表达的目的蛋白相对分子质量约为30000,经PEG修饰后,相对分子质量约为40000。初步分析显示,与突变型TCS相比,所构建的两个PEG修饰型TCS也显示出类似DNA酶活性。结论成功进行了TCS的定点突变及PEG修饰,为基因工程及化学修饰方法改造TCS提供了一条可行的途径。     

中药天花粉蛋白的定点突变及突变体的活性检测

选择天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS)分子中两个可能的抗原决定簇位点：Tyr81-Phe82-Phe83和Tyr94-Val95-Phe96进行了定点突变,将它们分别替换成Ala81-Gly82-Ser83和Ala94-Val95-Gly96,这两个突变体蛋白分别在大肠杆菌中成功地表达进行纯化,纯化后的突变体蛋白经初步检测发一其活性与野生型蛋白的活性几乎相同,而FF81－83AGS突变体的免疫原性有所降低。     

天花粉蛋白基因工程菌发酵条件研究

目的：通过对天花粉蛋白基因工程菌T239发酵条件研究，优化培养及表达条件。方法：研究温度、PH值、培养时间、培养基成分、接种量、诱导剂浓度等6种因素对于表达量的影响。结果：天花粉蛋白基因工程菌T239发酵条件在温度30℃、pH值7．3、摇床转速200r／min、50ml／500ml培养瓶、接种量3％、培养时间30h、添加葡萄糖浓度为2．0g／L时，表达量最高。讨论：发酵条件对于天花粉蛋白的表达量有很大的影响。