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1.
建立一种快速、稳定、灵敏度高的测定血浆中聚乙二醇尿酸酶浓度的高效液相色谱方法。将血浆样品与尿酸反应5 min,加入高氯酸终止,经高速离心,取上清液20μL检测。色谱柱采用Waters symmetry C18(4.6×250 mm,5μm),流动相为磷酸-甲醇-超纯水(3∶10∶487),流速1.0 mL/min,检测波长293 nm。通过体系中尿酸的降低值间接测定血浆中聚乙二醇尿酸酶的浓度。结果表明,聚乙二醇尿酸酶在31.25 ng/mL~20μg/mL范围内呈线性关系,r=0.999 4,日内、日间精密度均小于10%,回收率在88%~105%。 相似文献
2.
《中国生物制品学杂志》2014,(3)
目的在大肠埃希菌中表达球形节杆菌尿酸酶(uricase,Uri),并进行纯化和检测其活性。方法根据大肠埃希菌遗传密码子偏爱性,结合原核翻译起始序列的局部二级结构自由能最小化原则,优化设计编码Uri蛋白的核苷酸序列,经PCR扩增球形节杆菌uri基因,克隆至载体pET43.1a,构建重组表达质粒pET43.1a-uri,转化感受态大肠埃希菌BL21-odonPlus(DE3)-RIPL,IPTG诱导表达。表达产物经硫酸铵粗纯及DEAE琼脂糖凝胶层析纯化后,经SDS-PAGE分析纯度;参考Uri产品说明书测定蛋白酶活性,并确定其最佳检测温度及pH值。结果重组表达质粒pET43.1a-uri经酶切及测序鉴定构建正确;重组蛋白相对分子质量约33 000,以可溶性形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40%;纯化后纯度可达90%以上;酶活性达13.2 U/mg,酶活性检测最佳反应温度为40℃,最佳反应pH值为9.0。结论成功于大肠埃希菌中表达了uri基因,并获得高纯度的Uri蛋白,其酶学性质与天然的球形节杆菌尿酸酶基本一致,为其大规模稳定生产及尿酸酶法检测试剂的配制研究奠定了基础。 相似文献
3.
利用含PET-Urate Oxidase表达质粒的重组E.coli JM109(DE3)菌株进行大规模发酵培养,拟建立一种高效、低成本的生产重组尿酸酶的技术工艺路线。取冻存的工程菌接种于含质量分数1%琼脂的种子培养基中进行培养,从划线平板上挑取单菌落接种于摇瓶中继续培养,最后以体积分数5%接种量接种于发酵培养基中,绘制生长曲线;以乳糖作为诱导剂与传统IPTG诱导方法进行发酵培养比较;菌体经高压均质机破碎、质量分数40%~60%硫酸铵分级沉淀,以及Q-Sepharose F.F.层析进行分离纯化。结果显示,乳糖作为诱导剂在300 L的发酵罐中进行培养可获得菌体湿质量2 700 g,目的蛋白质表达量占菌体可溶性蛋白质的30%左右,略高于IPTG诱导的效果;经分离纯化后该酶的纯化倍数可达原来的4.5倍,活性回收率为40%;纯化的重组尿酸酶经SDS-PAGE和HPLC分析,显示单一蛋白质色带和单一洗脱峰。成果为该酶的医学实际应用奠定了理论实验基础。 相似文献
4.
目的制备产朊假丝酵母尿酸酶(uricase,URI)脂质纳米粒,并分析其药效学特性。方法采用旋转蒸发法制备3批URI脂质纳米粒(lipid nanoparticles containing uricase from Candida utilis,LNURI),检测其包封率、URI活性、酶的最适作用温度和最适作用pH值。采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾建立高尿酸大鼠模型,分别于建模后1 h经尾静脉注射LNURI和游离URI,建模后3、5、7、8、12 h,测定大鼠血清中尿酸水平。结果制备的3批LNURI的平均包封率为(64.27±2.26)%;LNURI的最适作用温度为40℃,最适作用pH值为8.0,在同样的作用温度和pH值条件下,LNURI的活性明显高于游离URI;LNURI降低高尿酸模型大鼠血清中尿酸水平的效果较URI更显著。结论成功制备了产朊假丝酵母尿酸酶脂质纳米粒,其可降低高尿酸模型大鼠血清中尿酸水平。 相似文献
5.
研究尿酸酶多囊脂质体(Uricase-multivesicular liposomes,UOMVLs)的酶学性质及其免疫原性。采用W/O/W复乳法制备UOMVLs,测定UOMVLs中尿酸酶(Uricase,UOX)的最适反应温度、最适反应p H值、热稳定性以及储存稳定性,并以其为抗原免疫SD大鼠,制备抗血清,通过间接ELISA法检测血清抗体效价。UOMVLs和UOX最适反应温度均为40℃;最适反应p H值分别为8.0和8.5;UOMVLs的稳定性明显高于UOX;UOMVLs和UOX的血清抗体效价分别为1∶500和1∶8 000。因此UOMVLs的酶学性质明显优于游离UOX,免疫原性明显低于游离UOX,为该酶的临床应用提供了实验依据。 相似文献
6.
研究了载尿酸酶聚乙二醇-透明质酸(Hyaluronic acid-graft-polyethylene glycol,HA-gPEG)/磺丁基-β-环糊精(Sulfobutyl ether-beta-cyclodextrin,SCD)自组装空心纳米微球(HA-gPEG/SCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase,UHPSD)在大鼠体内的药代动力学和生物等效性。大鼠单剂量静脉注射给予UHPSD和游离尿酸酶(Uricase,UOX),眼底静脉丛取血,测定给药后不同时间点大鼠血浆中尿酸酶的活性。采用DAS 2.1.1软件分析处理药动学数据,并对UHPSD和UOX进行生物等效性评价。UHPSD和UOX血药活性曲线符合二室模型。UHPSD提高了尿酸酶的生物利用度,UHPSD与UOX不具有生物等效性。 相似文献
7.
建立了一种测定重组猪尿酸酶活性的高效液相色谱方法。将重组猪尿酸酶基因工程菌的粗酶液与尿酸溶液反应5min,加入高氯酸溶液终止,经超滤后以体系中尿酸浓度的降低值为指标,采用HPLC法[色谱条件:AgilentZorbax 300SB-C18色谱柱、流动相为磷酸-甲醇-双蒸水(3∶25∶472,体积比)、流速1.0mL·min-1、波长292nm]测定粗酶液活性。结果表明,尿酸在10~500μmol·L-1范围内线性关系良好,样品回收率在99%~104%之间。该方法不受杂质干扰、稳定、灵敏度高,适用于尿酸酶粗酶液活性的检测。 相似文献
8.
基于碳纳米管修饰丝网印刷碳糊电极的葡萄糖和尿酸生物传感器 总被引:8,自引:2,他引:8
在丝网印刷碳糊电极上利用吸附法固定葡萄糖氧化酶或尿酸酶,并用碳纳米管进行修饰,铁氰化钾作为电子传递剂,制作用于测量人体血浆中葡萄糖和尿酸浓度的生物传感器.葡萄糖传感器的响应时间仅为5 s,响应电流范围为1.2~30μA,线性测量范围为1~33.3 mM,尿酸传感器响应时间为和电流范围分别为50 s,0.7~14μA,线形测量范围是2~20 mg/dL.用碳纳米管修饰酶电极,改善了电极表面条件,加快了电极反应速度,并提高了传感器的灵敏度.通过碳纳米管修饰电极,葡萄糖传感器的灵敏度从0.333 8μA/mM提高到0.843 2μA/mM,尿酸传感器的灵敏度从0.402 8μA/(mg/dL)提高到0.713 8μA/(mg/dL). 相似文献
9.
10.
制备载尿酸酶(Uricase,UOX)聚乙二醇-透明质酸(Hyaluronic acid-graft-poly(ethylene glycol),HA-g-PEG)/羟丙基-β-环糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin,HPCD)自组装空心纳米微球(HA-g-PEG/HPCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase,UHPHD),并研究其体外稳定性。制备UHPHD,并测定其包封率、粒径及Zeta电位。再分别从最适温度、最适pH、热稳定性、贮存稳定性、酸碱稳定性和抗胰蛋白酶水解能力初步考察游离UOX和UHPHD的差异。结果:UHPHD的包封率为(62.17±2.94)%,粒径和Zeta电位分别为(299.60±13.05)nm和(-45.10±2.75)mV。UHPHD和UOX最适温度均为40℃,最适pH均为8.5。体外稳定性结果显示,UHPHD的体外稳定性明显高于UOX。 相似文献