(R)-1-苯基-1,2-乙二醇脱氢酶的纯化及酶学性质

高压匀浆破碎近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCCM203011)得酶粗提液,经乙醇沉淀、DEAE-Sephacel离子交换层析、SuperdexG-75凝胶层析及亲和(Cibacron Blue 3GA)层析纯化得到以NADP+为辅酶的醇脱氢酶,SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,纯化后比活力提高20倍.HPLC凝胶柱层析法检测相对分子质量为45 000,SDS-PAGE电泳测得相对分子质量为43 000,表明该酶为单亚基结构.以(RS)-1-苯基-1,2-乙二醇(简称苯乙二醇)为底物,该酶最适反应温度为45℃,最适反应pH值为8.0.金属离子中Mg2+对酶活的有一定激活作用.以纯酶催化转化消旋体苯乙二醇,该酶优先选择(R)型对映体为底物.     

来源于P.bacterium 1109的甘露醇脱氢酶的重组纯化及酶学性质研究

本文将来自P.bacterium 1109的甘露糖醇脱氢酶(MDH)表达并提取纯化,研究了该重组酶的酶学性质及其在甘露醇生产中的工艺条件。结果显示重组MDH是一个相对分子量为37 kDa的四聚体。氨基酸序列比对发现其与大多数MDHs的同源性小于40%。该酶的最适pH和温度分别为8.5和80℃,且当金属离子Zn2+存在时,重组MDH的活力提高到对照组的260%。此外,重组MDH在75℃孵育6 h后仍可保留超过85%的残留活性,热稳定性较高,比大多数MDHs的活性高。底物特异性研究表明其对D-果糖具有较高的专一性。重组MDH催化D-果糖的米氏常数(K_m)和催化效率(k_cat/K_m)分别为20 mmol/L和7.5 L/(mmol·min)。重组MDH在以400 mmol/L的D-果糖为底物的反应系统中,可将80%以上的D-果糖转化为甘露糖醇。通过对反应条件的优化,为后续工业化生产制备甘露醇奠定了基础。     

不同诱导物对白地霉中高级醇脱氢酶的影响

化学或物理因子作为诱导物,能够直接或间接影响菌体基因转录表达。为探索高级醇底物对白地霉的诱导效果,以分离自土壤的白地霉S12为对象,采用五种高级醇（正丙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇和异戊醇）作为诱导物,研究不同高级醇的诱导剂量、诱导时间对菌体S12降解不同高级醇活性及脱氢酶活力的影响。结果表明,当正己醇和异丁醇分别作为诱导剂时,胞内酶活力较高。正丙醇、正丁醇、异丁醇和正己醇作为诱导剂时,最适诱导时间均为6 h;而以异戊醇为诱导剂时,最佳诱导时间为12 h。以正丙醇和正己醇为诱导剂时,最适的诱导浓度为1.5 g/L;以正丁醇、异丁醇和异戊醇为诱导剂时,最适诱导浓度分别为1.0、0.5和2.5 g/L。NativePAGE电泳结果表明,以五种高级醇为诱导剂均能使菌体合成分子量为223 kDa左右的脱氢酶。其中,以正己醇为诱导剂时所得菌体同时降解多种高级醇的能力最强,其降解产物均为其相应的酸类和酯类物质。     

1，3-丙二醇脱氢酶一步纯化与杂化凝胶固定化的初步研究

转录表达来源于Klebsiella．pl,3-丙二醇脱氢酶（PDH）基因片段的E．coli工程菌,在5L发酵罐、30℃、pH值7．0、200r／min（微氧）条件下培养20h;发酵菌体经破碎分离后所得样品通过HisTrap HP柱亲和层析一步纯化得到电泳纯的PDH,纯化倍数为2．94倍,活性回收率为50％,经SDS-PAGE电泳鉴定获得一条清晰条带,表达蛋白亚基相对分子质量约为41kDa。用改进的溶胶-凝胶法（杂化凝胶）包埋纯化酶,考察正硅酸乙酯（TEOS）浓度、海藻酸盐（ALG）浓度、CaCl2浓度及ALG与TEOS体积比等因素对酶固定化效果的影响,结果表明,较优包埋条件为：ρ（TEOS）=20g／L,ρ（ALG）=30g／L,ρ（CaCl2）40g／L,V（ALG）：V（TEOS）=3：1;由此制备的PDH的ALG-SiO2杂化凝胶保藏60天后酶活仍保持80％,进行批次反应时,反应3批后酶活保持70．3％,反应第6批时酶活剩余29.8％。     

醇脱氢酶催化合成(S)-哌啶醇及产物抑制机制

(S)-N-Boc-3-羟基哌啶((S)-NBHP)是治疗套细胞淋巴瘤药物——依鲁替尼的关键手性中间体。利用醇脱氢酶催化N-Boc-3-哌啶酮(NBPO)的不对称还原是最具开发潜力的(S)-NBHP合成方法。对醇脱氢酶库进行筛选发现,来源于多孢克鲁维酵母的Kp ADH对NBPO具有最佳的催化效果,纯酶活力高达83.9 U/mg,产物对映体过量值为97.0%(S)。将其与葡萄糖脱氢酶偶联,并考察了单水相、两相、离子液体和不同底物浓度对转化反应的影响。结果表明:高浓度产物(S)-NBHP对Kp ADH存在抑制作用,抑制动力学分析表明属于非竞争性抑制。采用单水相体系可降低(S)-NBHP对Kp ADH催化反应的抑制,有利于转化效率的提高。初步探究了醇脱氢酶催化NBPO不对称还原反应的抑制现象,对酶法合成(S)-NBHP具有指导意义。     

Improved Ethanol Production from Xylose by Candida shehatae Induced by Dielectric Barrier Discharge Air Plasma

Xylose fermentation is essential for ethanol production from lignocellulosic biomass. Exposure of the xylose-fermenting yeast Candida shehatae （C. shehatae） CICC1766 to atmospheric pressure dielectric barrier discharge （DBD） air plasma yields a clone （designated as C81015） with stability, which exhibits a higher ethanol fermentation rate from xylose, giving a maximal enhancement in ethanol production of 36.2% compared to the control （untreated）. However, the biomass production of C81015 is lower than that of the control. Analysis of the NADH （nicotinamide adenine dinucleotide）- and NADPH （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）- linked xylose reductases and NAD＋-linked xylitol dehydrogenase indicates that their activities are enhanced by 34.1%, 61.5% and 66.3%, respectively, suggesting that the activities of these three enzymes are responsible for improving ethanol fermentation in C81015 with xylose as a substrate. The results of this study show that DBD air plasma could serve as a novel and effective means of generating microbial strains that can better use xylose for ethanol fermentation.     

醇脱氢酶在聚乙烯膜表面的固定化研究

以聚丙烯酸(PAA)改性的聚乙烯(PE)膜为载体,研究了醇脱氢酶(ADH)的两种固定化路线,并以甲醛为底物考察了固定化酶的催化性能。路线1用聚乙烯亚胺(PEI)进一步改性,使用戊二醛(GA)固定化ADH。最优固定化pH为6.0,温度为5～15℃,酶浓度为1.0 mg/ml,GA浓度为0.01%(质量);固定化酶的最适反应pH为6.5,温度为15～30℃,反应速率最高为9.6μmol/(L·min);重复利用10次后可保持47.3%的活性。路线2以PAA-PE为载体,用1-(3-二甲氨基丙基)-2-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂,固定化ADH。EDC和NHS最优摩尔比为1∶0.5,固定化时间为24 h;固定化酶的最适反应pH为6.5,温度为20～37℃,反应速率为15.58μmol/(L·min);重复利用10次后可保持53.8%的活性。     

黄金茶红茶加工过程中香气成分及其相关酶活性的动态变化

为探究黄金茶红茶在萎凋、揉捻、发酵等加工工序中 β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-GC)、醇脱氢酶(al-cohol dehydrogenase,ADH)、脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)和主要香气成分的动态变化,该研究以黄金茶一芽二叶为原料,按照红茶工艺进行加工,测定其加工过程中 β-GC...     

黄酒酵母β-苯乙醇合成途径醇脱氢酶I的异源表达及酶学特性

醇脱氢酶 I (Adh1p)是黄酒酵母艾利希途径最后合成β-苯乙醇的一个关键酶。为探究黄酒酵母Adh1p的差异及酶学特性,以工业生产菌株黄酒酵母HJ和模式菌株酿酒酵母S288C的基因组为模板,设计引物PCR扩增醇脱氢酶编码区基因ADH1,构建pET-28a(+)表达质粒,转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达获得Adh1p。通过超声破碎菌体后获取粗酶液,亲和层析纯化后获取纯酶,进而探究酶学特性。以苯乙醛为底物,酶活性测定表明:来自黄酒酵母的Adh1pHJ纯酶的酶活(231.51 U/g) 比来自酿酒酵母的Adh1pS288C (203.48 U/g)高13.79%,且Adh1pHJ的Km值(0.524 μmol/L)小于Adh1pS288C的Km值(0.759 μmol/L),表现为Adh1pHJ与底物的亲和力更大。从kcat/Km值发现Adh1pHJ(0.406 L/(μmol·min))的催化效率更高。Adh1pHJ耐受β-苯乙醇和乙醇的能力较高于Adh1pS288C。本研究结果为Adh1p的结构以及酶学性质分析提供方法和理论依据,同时也对β-苯乙醇工业生产开发提供借鉴。     

共表达xyl1、xyl2和tal1重组酿酒酵母的构建及木糖发酵研究

将来自树干毕赤酵母的木糖还原酶基因(xyl1)、木糖醇脱氢酶基因(xyl2)和酿酒酵母自身的木糖转醛酶基因(tal1),通过串联共表达的方法构建到表达载体pAUR123上,构建了1株重组酿酒酵母。该菌在打通木糖向木酮糖转化通路基础上,超表达木糖转醛酶。该菌以木糖为唯一碳源进行限氧发酵,能初步利用木糖。结果表明,木糖的利用率为77.4%,但乙醇产率仅为0.04 mg/mL。同时探讨了3种酶共表达对酿酒酵母发酵木糖生成乙醇的影响,发现3种酶对木糖的利用起关键性的作用,其过量表达导致木糖醇大量积累,乙醇得率降低。