节杆菌β-呋喃果糖苷酶的纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、透析脱盐、Sepharose 6B凝胶色谱等分离纯化技术，从节杆菌培养液分离纯化了β-呋喃果糖苷酶，纯化倍数为18．29，回收率为44．81％，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一条明显的蛋白质谱带。相对分子量为55800~，该酶的最适pH为6．5，最适温度为30℃2，pH6．0～8．0之间和45℃以下稳定，Ag 和Cu^2 对该酶有较强烈的抑制作用，EDTA和镁离子对酶活的影响较小。     

米曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及生物信息学分析

β-呋喃果糖苷酶水解蔗糖和低聚果糖,酶法生产高纯度低聚果糖,必须抑制或消除β-呋喃果糖苷酶的水解活性.本研究以工业生产低聚果糖的米曲霉菌株GX0015为研究材料,采用RT-PCR技术,克隆获得β-呋喃果糖苷酶基因(GenBank登录号:EU130944).利用生物信息学手段对β-呋喃果糖苷酶基因进行分析得知:该酶为456个氨基酸组成的亲水性膜外蛋白;功能域分析结果显示:该酶从第52个至第456个氨基酸残基之间序列属于糖苷酶32家族特征序列,并具有糖苷酶32家族酶活性中心的(N/G)DP(C/N)G和RDP保守序列;米曲霉β-呋喃果糖苷酶在进化树上的位置处于酵母菌的转化酶和细菌的六磷酸蔗糖水解酶之间.     

磁性壳聚糖、海藻酸钠固定β-呋喃果糖苷酶研究

分别以海藻酸钠、壳聚糖复合Fe3O4为载体,采用包埋―交联法固定β–呋喃果糖苷酶。对固定化过程氯化钙浓度、戊二醛浓度、加酶量、包埋时间、交联时间等因素进行考察;并采用正交试验对载体制备与酶固定化中主要条件进行优化;通过对固定化酶活力回收比较,磁性海藻酸钠固定化酶活力回收率优于磁性壳聚糖。     

节杆菌10137β-呋喃果糖苷酶基因克隆及在大肠杆菌表达

以一株高产β-呋喃果糖苷酶的节杆菌10137基因组为模板,成功地扩增出β-呋喃果糖苷酶基因,基因片段长度为1488bp,编码496个氨基酸。将扩增出的目的片段克隆到pFL-B13cl载体上,通过双酶切鉴定,确定该基因已成功克隆至表达载体。研究不同表达条件对β-呋喃果糖苷酶活性的影响,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导温度22℃,诱导12h,比酶活可达1412.30U/g,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白分子质量大小约为67u,亲和层析纯化后比酶活为2207.48U/g。将重组大肠杆菌在2L发酵罐中培养,诱导10h后β-呋喃果糖甘酶的比酶活为1208.23U/g。     

β-呋喃果糖苷酶的生产及对甜菊苷和莱鲍迪A苷的酶法改性研究

用Arthrobacter sp.10137生产一种β-呋喃果糖苷酶(FFase),SDS-PAGE检测纯化后的酶分子质量为48.7ku左右,酶的比活力为19.81U/mg。纯酶的最适pH值和温度分别为6.5和40℃,并在pH6～8及40℃以下稳定。纯酶对甜菊苷和莱鲍迪A苷改性的最适条件是:酶量为15U/mL,莱鲍迪A苷和甜菊苷与蔗糖的摩尔比分别为0.0005:1和0.0012:1,反应时间为15h。在最适条件下,莱鲍迪A苷和甜菊苷的最大转化率分别为69.4%和72.0%。     

节杆菌β-呋喃果糖苷酶的纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、透析脱盐、Sepharose 6B凝胶色谱等分离纯化技术，从节杆菌培养液分离纯化了β-呋喃果糖苷酶，纯化倍数为18．29，回收率为44．81％，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一条明显的蛋白质谱带。相对分子量为55800左右，该酶的最适pH为6．5，最适温度为30℃，在pH6．0-8．0之间和45℃以下稳定，Ag^ 和Cu^2 对该酶有较强烈的抑制作用，EDTA和镁离子对酶活的影响较小。     

响应面法优化离子交换法固定化β-D-呋喃果糖苷酶

以大孔阴离子树脂D311 为载体,对日本曲霉来源的β-D- 呋喃果糖苷酶进行离子交换法固定化。研究温度、pH 值、时间、游离酶液酶活力对固定化效果的影响,并在此基础上运用响应面法对固定化条件进行优化。结果表明,最佳固定化条件为：室温、pH6.6、固定化时间4h、游离酶液酶活力为900U/mL,在此条件下,固定化β-D- 呋喃果糖苷酶生产的低聚果糖产量可达58.16%。