重金属铅酶联免疫检测方法的研究

制备铅离子多克隆抗体,并建立间接竞争ELISA检测方法。利用双功能螯合剂ITCBE将Pb2+与载体蛋白KLH和BSA偶联在一起,制备免疫抗原与检测抗原;通过免疫新西兰大耳白免成功制备铅多克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法,并与ICP-MS检测结果进行比较。标准曲线IC50为3.48ng/mL,IC15为0.32ng/mL,与ICP-MS法检测结果的总符合率超过97%。     

双酚A二环氧甘油醚的免疫检测方法研究

目的快速检测湖水中的双酚A二环氧甘油醚。方法试验设计一种新型双酚A二环氧甘油醚半抗原,并成功与载体蛋白偶联,经过小鼠免疫、细胞融合技术和三次亚克隆等方法,成功筛选出了可以稳定分泌BADGE单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果成功制备了高灵敏度高特异性的双酚A二环氧甘油醚单克隆抗体,可以用于针对双酚A二环氧甘油醚的间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)。基于单克隆抗体,绘制了标准曲线,结果显示,单克隆抗体的IC50=1.15 ng/mL,检测线性范围IC20～IC80为0.16～8.15 ng/mL。通过加标回收实验,BADGE在湖水的添加回收率均在80%～120%之间。结论双酚A二环氧甘油醚单克隆抗体在实际湖水样品检测中的运用具有可行性。     

副溶血性弧菌多克隆抗体制备及应用

以热灭活副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP ATCC17802)免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用间接酶联免疫吸附法测定抗血清效价,纯化后的多克隆抗体效价为512000。该抗体与5株副溶血性弧菌均能特异性结合,但与其他12株非副溶血性弧菌无交叉反应。在此基础之上建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA),并优化了抗原抗体浓度、二抗浓度、封闭液等条件。结果表明,该法的线性范围为5×10^4~107CFU/m L,线性回归方程为y=0.21x-0.74(R2=0.99),IC50为106CFU/m L,最低检出限为1.7×10^4CFU/m L,板内变异系数为2.61%~4.15%,板间变异系数为4.71%~8.74%。用建立的ic-ELISA检测市场中鱼、贝类养殖水和实验室用水中的VP,实验结果与国标检测方法的结果一致。该方法快速便捷,灵敏度高,准确性好,为进一步研究VP的快速检测奠定了基础。     

玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA方法的建立

本研究以玉米面为例,建立了玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA (ic-ELISA)方法.采用棋盘滴定法确定抗原和单抗的最佳工作浓度,并确定了抗原37℃包被1h、不封闭、酶催化底物作用时间15 min的反应条件进行检测.该方法的检测范围(IC20～IC80)为11 ～292 pg/mL,检测限(IC10)为6 pg/mL.玉...     

除草剂异丙甲草胺特异性抗体制备及免疫检测方法的建立

为检测食品中的异丙甲草胺农药残留,降低其对人体可能造成的危害,本文建立了基于抗体的酶联免疫分析方法。首先以除草剂异丙甲草胺、3-巯基丙酸为原料合成半抗原,经由氢核磁共振和质谱方法鉴定后,通过碳二亚胺（EDC）法将半抗原与载体蛋白偶联制备异丙甲草胺人工抗原,免疫新西兰大白兔获取抗体,通过棋盘滴定确定抗原抗体最佳稀释倍数,ELISA反应的抗体稀释液为PBS（1% PEG 6000）,药物稀释液为PBS（10%甲醇）,在此基础上建立间接竞争ELISA标曲,其IC50为14.64 ng/mL,检测限（limit of detection,LOD）为0.8 ng/mL,线性检测范围IC20~IC80为1.51~141.92 ng/mL。与14种结构类似物进行交叉反应,交叉反应率低于3%。向环境水样中添加异丙甲草胺,回收率为86.60%~102.16%,变异系数（RSD）为7.05%~13.30%。此抗体灵敏度高特异性好,可用于食品和环境中异丙甲草胺的监测。     

间接竞争ELISA法检测呋喃唑酮代谢物

以人工抗原和特异性抗体为基础,建立了以2-硝基苯甲醛为衍生试剂检测呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定和间接竞争法确定ELISA方法的抗原抗体的最佳工作浓度;得到标准曲线的线性范围为0.25~10ng/mL,线性关系良好;根据标准曲线计算IC50为0.5881~1.1333 ng/mL。此外,检测了与其他类似物的交叉反应率,显示了很好的特异性;并且通过对虾样品添加回收率的测定,证明了该方法的准确性。高温短时间衍生化处理可达到与37℃孵育过夜同样的衍生效果。     

4-甲基苯酚多克隆抗体的制备及应用

针对4-甲基苯酚(4-MP)的结构特点及半抗原设计原则,选择对羟基苯丙酸(34-HPA)作为半抗原,通过活化酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联合成人工免疫原,免疫3～4 m的雄性大白兔,制得多克隆抗体效价为1∶204 800。同时采用混合酸酐法合成半抗原-卵清蛋白(OVA)偶联物作为包被原,以4-MP为竞争的抗原,建立间接竞争ELISA检测方法。实验结果表明,理想工作条件为:包被原浓度1.05μg/mL,抗体稀释倍数1∶12 800,酶标二抗稀释倍数1∶1 000,0.1%明胶封闭1.5 h,竞争时间与酶标二抗反应时间均为1.0 h。4-甲基苯酚在δ1.0×10-2～1.0×103的范围内呈线性相关,得标准曲线方程y=-12.76x+66.66,最低检测限δ0.02,板内差异为7.0%,板间差异为8.4%。     

蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA检测方法的建立

目的:旨在建立一种检测蘑菇中鹅膏毒肽（Amanitin, AMA）的间接竞争酶联免疫吸附方法（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, ic-ELISA）。方法:通过EDC/NHS在α-鹅膏毒肽的羧基位置引入6-氨基己酸得到半抗原,并进一步与不同的载体蛋白偶联制备免疫原和包被原。之后,利用免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。基于所获得的抗体,并通过对包被原和抗体工作浓度、包被条件、封闭条件、酶标二抗工作浓度和孵育时间等条件的优化,建立了蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA检测方法,最后对所建立方法的灵敏度、添加回收率、批内及批间变异等参数进行了评价。结果:合成的半抗原分子量为1033.12,经MALDI-TOF鉴定免疫原的偶联比约为10.03。基于杂交瘤技术制备、筛选出鼠单克隆抗体13H4的IC₅₀为1.91 μg/L。基于所获得单克隆抗体,所建立蘑菇中鹅膏毒肽间接竞争ELISA方法的检出限为0.88 μg/kg,添加回收率为85.66%~113.05%,批内变异系数为5.35%~9.54%,批间变异系数小于15%。结论:本研究所建立的ic-ELISA方法准确度、精密度、灵敏度较高、性能稳定,为突发毒蘑菇中毒事件的毒原分析提供了一种简便、可靠的快速检测方法。     

糖皮质激素广谱特异性单克隆抗体的制备及其ic-ELISA方法的建立

将氢化可的松半抗原HYD通过活化脂法与钥孔戚血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶联获得氢化可的松完整抗原KLH-HYD,并对小鼠肌肉注射此抗原,使小鼠免疫;通过杂交瘤技术获得1 株能够稳定分泌氢化可的松的单克隆抗体细胞株HYD-C1,并通过腹水制备大量抗体。将氢化可的松半抗原HYD和地塞米松半抗原DEX通过活化脂法分别与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）偶联作为包被原,建立糖皮质激素的间接竞争酶联免疫吸附检测（indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）方法。结果：在同源包被情况下氢化可的松灵敏度为1.63 ng/mL,异源包被情况下灵敏度为0.24 ng/mL;在交叉抑制实验中,异源策略中的各糖皮质激素灵敏度均高于同源策略中的结果,异源策略条件下很好地覆盖了本研究中所检测的糖皮质激素,使该抗体具备良好的广谱特异性。在异源策略添加回收实验中平均添加回收率在77.5%～111.3%之间,落在合理范围内,满足检测需求。结论：成功制备出氢化可的松单克隆抗体,建立了同源和异源策略糖皮质激素检测方法,结果发现异源策略中糖皮质激素的灵敏度高于同源策略,并使该方法具有更好的广谱特异性。     

鸡、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺间接竞争ELISA检测方法研究

目的：建立一种检测鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺的间接竞争酶联免疫吸附方法（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA）。方法：本研究基于间接竞争酶联免疫方法的原理,在酶标板微孔中预包被偶联抗原,样本中含有的金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺与微孔中预包被的偶联抗原特异性地竞争酶标记抗体,催化底物显色,根据显色深浅来计算样本中金刚烷胺类药物的含量。结果：金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺的检测限分别为：0.57、0.42、0.41 μg/kg （鸡肉）和0.59、0.40、0.38 μg/kg （鸭肉）;定量限分别为0.85、0.63、0.69 μg/kg （鸡肉）和0.94、0.68、0.52 μg/kg （鸭肉）;添加回收率范围为67.0%~117.9%;日内变异系数6.3%~12.7%,日间变异系数8.1%~14.5%,且实际样品检测结果与HPLC-MS一致性较高（R²=0.9990）,表明该方法具有良好的准确度和精密度。结论：本研究建立的ic-ELISA方法适用于鸡鸭肉样品中金刚烷胺类药物残留的检测,方法的灵敏度高、稳定性好,可应用于批量样本的快速筛查,具有良好的实际应用价值。