TGF-β R Ⅱ真核表达载体及其RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建含有TGF-βⅡ型受体(TGF-β R Ⅱ)的真核表达载体及针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰质粒,并观察RNA干扰对TGF-β R Ⅱ表达的抑制作用。方法PCR方法扩增TGF-β R Ⅱ的cDNA序列,将全长的TGF-β R ⅡcDNA插入pcD-NA3.1中,构建TGF-β R Ⅱ的真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β R Ⅱ,并检测其在293T细胞中的表达。根据TGF-β R Ⅱ的基因序列,设计针对TGF-β R Ⅱ的干扰RNA,构建针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰质粒pSUPER-TGF-β R Ⅱ。脂质体介导质粒pSUPER-TGF-β R Ⅱ和pcDNA3.1-TGF-β R Ⅱ共转染293T细胞,Western blot法检测RNA干扰质粒的生物活性。结果真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β R Ⅱ和RNA干扰质粒pSUPER-TGF-β R Ⅱ经酶切鉴定构建正确,测序结果显示未发生基因突变。间接免疫荧光检测pcDNA3.1-TGF-β R Ⅱ转染的293T细胞,可见绿色荧光。针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰质粒明显抑制293T细胞内TGF-β R Ⅱ的表达。结论已成功构建了TGF-β R Ⅱ的真核表达载体及针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰质粒,为进一步研究针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰对肾纤维化的预防及治疗作用奠定了基础。