| 嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB~*的构建与鉴定 |
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| 引用本文： | 高淼,黄峥兰,李千音,钟梁,冯文莉.嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB~*的构建与鉴定[J].粉末涂料与涂装,2012,25(10):1276-1280. |
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| 作者姓名： | 高淼 黄峥兰 李千音 钟梁 冯文莉 |
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| 作者单位： | 重庆医科大学临床血液学教研室 临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆,400016 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金(项目编号：81070421) |
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| 摘 要： | 目的构建携带FLAG-3NLS-FRB*融合基因的嵌合腺病毒,并检测其在AD-293细胞中的表达。方法将FLAG标记的3段核定位信号(FLAG-3NLS)与突变修饰的雷帕霉素靶FRB结构域(FRB*)基因通过重叠PCR技术拼接成FLAG-3NLS-FRB*,定向克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pAd5F35在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,感染AD-293细胞进行包装、扩增。采用基因转移单位(Gene transfer unit,GTU)法测定病毒滴度;RT-PCR及Western blot检测FLAG-3NLS-FRB*在AD-293细胞中的转录及表达。结果腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-FLAG-3NLS-FRB*经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;FLAG-3NLS-FRB*正确克隆至腺病毒骨架质粒中;在AD-293细胞中包装、扩增获得了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,病毒滴度为2.0×1013GTU/ml;嵌合腺病毒感染AD-293细胞后36 h,在细胞中可检测到FLAG-3NLS-FRB*基因的转录和蛋白的表达。结论成功构建了高滴度的嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*,并在AD-293细胞中成功表达了FLAG-3NLS-FRB*融合蛋白。
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| 关 键 词： | 嵌合腺病毒 同源重组 核定位信号 FRB |
Construction and identification of chimeric adenovirus Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB* |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Chimeric adenovirus Homologous recombination Nuclear localization signal(NLS) FRB |
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