聚乙二醇化人睫状神经营养因子蛋白含量反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的建立聚乙二醇化重组人睫状神经营养因子(PEGylated ciliary neurotrophic factor,PEG-CNTF)蛋白含量反相高效液相色谱(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测方法,并进行验证。方法以未修饰的人CNTF原型蛋白为对照品,采用反相高效液相色谱法(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定PEG-CNTF的蛋白含量。色谱柱:Jupiter 5u C4 300A(150 mm×4.6 mm);流动相:0.1%三氟乙酸的水溶液、0.1%三氟乙酸的乙腈;检测波长:280 nm;流速:1 mL/min;柱温:室温;进样体积:20μL。对该方法进行专属性、线性、精密性、准确性、耐用性验证。结果空白溶剂在CNTF、PEG-CNTF样品设定积分范围内无特异峰出现;建立的方法在PEG-CNTF含量为0.125～4 mg/mL浓度范围内线性关系良好(R2 0.99);供试品重复性检测的相对标准偏差(RSD)分别为0.21%、0.19%、0.45%,中间精密性检测的RSD分别为0.42%、0.59%、0.83%;制备的高、中、低3个浓度供试品检测结果的回收率均在95%～101%之间;该方法的定量限为50μg/mL,检测限为15.625μg/mL;耐用性验证中连续5次进样CNTF、PEG-CNTF峰面积及保留时间的RSD均小于2%。结论建立的方法具有良好的专属性、线性、精密性、准确性、耐用性,可用于PEG-CNTF中蛋白含量的检测。