| 摘 要： | 目的通过毕赤酵母GAP启动子高效分泌表达人胰岛素前体,并检测重组胰岛素类似物的生物活性。方法经密码子优化并人工合成人胰岛素前体基因IS基因,插入pGAPZaA组成型表达载体中,构建重组表达质粒pGAPZaIS,电转化至感受态毕赤酵母SM1168菌株中,PCR鉴定阳性重组子;高抗性YPD平板筛选高蛋白表达株并优化表达条件;表达产物经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析;用吸附树脂吸附、阳离子交换层析、超滤纯化后,用经TPCK处理的胰蛋白酶切除人工C肽,经阴离子交换层析和醋酸锌沉淀纯化后,进行Tricine-SDS-PAGE分析;将12只链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)致糖尿病模型的小鼠随机分为A组和B组,A组小鼠经腹腔注射含1.8%甘油的注射用水作为对照组,B组小鼠经腹腔注射用胰岛素类似物配制的0.05 mg/ml注射用水剂(含1.8%甘油),10μl/g,空腹6 h后,断尾取血,用血糖仪检测小鼠血糖值。结果重组表达质粒pGAPZa-IS经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;共获得5株高抗性重组菌,其表达产物均可见相对分子质量约6 000的目的蛋白条带,与小鼠抗胰岛素单克隆抗体不发生特异性反应,5号菌72 h表达量最高;C肽切除后,获得了纯胰岛素类似物;模型小鼠在注射胰岛素类似物6 h后,血糖值均明显降低,B组小鼠注射前后血糖值及A、B组间的血糖值差异均有统计学意义(P<0.01)。结论在毕赤酵母中,利用GAP启动子成功高效表达了胰岛素前体,并具有良好的降血糖活性。
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