真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的体外重组与纯化研究

将真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域克隆到表达载体pQE30中，并转化到大肠杆菌XL-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选，并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后，进行序列测定。序列测定结果显示，该基因结构正确，且准确插入到表达载体启动子的下游，获得了结构和组成正确的重组子。重、组子经IPTG诱导后，以SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果表明，该基因在大肠杆菌XL-blue中实现了表达。通过对诱导条件的调整，在体外获得了高效表达的重组蛋白，高效表达的重组蛋白约占菌体蛋白的25％-30％。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示，随诱导时间的增加，重组蛋白产量逐渐增高，经4h诱导，其表达量可以达到平台期，过长时间的诱导，对表达产量没有影响。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化，获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法，用Sephadex G150，对重组蛋白进行脱盐复性，使重组蛋白得到了进一步纯化。