艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的原核表达及其胶体金免疫层析检测方法的建立

目的原核表达艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH),并建立GDH胶体金免疫层析检测方法。方法以艰难梭菌(ATCC BAA-1382)全基因组为模板,PCR法扩增GDH基因,并克隆至载体pET-30a(+),将重组质粒转染至E. coli BL21(DE3),诱导表达重组GDH,并优化IPTG终浓度(0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mmol/L)、诱导时间(0、2、4、6 h)及诱导温度(31、34、37℃),表达产物采用Ni-NTA purificationSystem进行纯化。用纯化蛋白免疫家兔,以获得的多克隆抗体作为金标抗体,制备胶体金试纸条,并验证其灵敏性、特异性、精密性及稳定性。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒p ET-30a-GDH构建正确。最适诱导表达条件为:于37℃,IPTG终浓度为0. 8 mmol/L诱导4 h。获得的免疫血清效价达1∶51 200,制备的胶体金试纸条灵敏性为60 ng/mL,与其他肠道菌无交叉反应,批内、批间结果无差异,且具有良好的稳定性。结论原核表达了重组GDH,成功建立了GDH胶体金试纸条检测方法,且灵敏性、特异性、精密性及稳定性均良好,具有临床应用价值。

Prokaryotic expression of glutamate dehydrogenase of Clostridium difficile and development of a colloidal gold immunochromatography assay