双重TaqMan实时荧光PCR同时检测沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立

以建立沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌双重Taq Man PCR方法为例,阐述Taq Man PCR方法建立的系统步骤和关键要素为目的,采用根据沙门氏菌Fim Y和单核细胞增生李斯特菌iap基因序列利用ABI primer express 3.0软件设计了物种特异性引物和Taq Man探针,采用标准曲线优化法对双重反应体系中引物和探针、Mg2+、d NTP浓度和Taq酶用量以及热循环条件等关键要素进行了优化,借助单双重PCR比较试验、多重PCR高低丰度模板抑制试验、灵敏度、特异性和重复性试验对建立的方法进行了验证进而得出了这样的结果:我们建立了涵盖设计要素、质控设置、体系优化、评价指标、验证试验共5个关键环节的双重Taq Man实时荧光PCR方法建立模式。建立的方法灵敏度高,沙门氏菌100CFU/ml,单增750CFU/ml;特异性强,对8种阳性菌株和37种近缘及远缘关系的阴性菌株成功鉴别的方法。本研究可借鉴应用于所有以核酸为检测对象的Taq Man PCR方法的建立模式。