| 摘 要： | 利用PCR技术从嗜热细菌莱廷格热袍菌TMO中扩增得到普鲁兰酶TMP的基因(Tlet_1262),将该基因克隆至表达载体p ET15b,并经IPTG诱导在大肠杆菌BL21-Coden Plus(DE3)-RIL中实现可溶性表达。通过80℃热处理和镍柱亲和层析两步纯化,得到纯化重组酶。SDS-PAGE分析表明:该酶分子质量为97.0 ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度90℃,最适p H 5.4。在最适反应温度90℃处理150 min,酶活力稳定在80%以上。普鲁兰酶TMP具有较强的耐酸性,在90℃高温和p H 5.0的酸性条件处理20 h,仍保持50%以上的活性。该酶对金属离子和变性剂SDS、尿素、Tween80和Trtion-X100具有一定抗性。还原剂DTT(0.5,5 mmol/L)对该酶活性具有明显激活作用,分别提高酶活18%和28%。在此基础上,利用重叠PCR构建普鲁兰酶TMP点突变体C501S、C649S和C704S。通过动力学分析,点突变体C649S催化普鲁兰糖和可溶性淀粉底物的效率(kcat/Km)相对于野生型分别提高37.8%和40.8%。由此推测C649位点可能与普鲁兰酶TMP催化功能密切相关。
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