二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达及生物学特性鉴定 |
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引用本文: | 凌媛,徐静,许丽锋,崔文禹,李媛媛,李树香.二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达及生物学特性鉴定[J].粉末涂料与涂装,2009,22(8). |
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作者姓名: | 凌媛 徐静 许丽锋 崔文禹 李媛媛 李树香 |
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作者单位: | 北京生物制品研究所,北京,100024 |
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摘 要: | 目的构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体原核表达质粒,并进行表达和生物学特性鉴定。方法利用SWISS-PROT软件分析抗TNF-α单链抗体(scFv)的结构,并结合二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)的突变位点设计原则,确定其突变位点,采用PCR定点突变的方法,构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosy)l对表达的目的蛋白进行可溶性纯化,并进行抗原结合活性、相对稳定性及细胞毒中和活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确。抗TNF-α的ds-scFv的表达量占菌体总蛋白的16.6%,主要以包涵体形式表达;纯化的目的蛋白纯度可达94.4%;经ELISA及Western blot验证,ds-scFv与TNF-α抗原的结合活性与scFv相近;相对稳定性优于scFv;在同样的抗体浓度下,scFv和ds-scFv的细胞毒中和活性略低于亲本鼠单抗,ds-scFv略高于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达质粒,并获得有活性的目的蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
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关 键 词: | 肿瘤坏死因子-α 二硫键稳定的单链抗体 原核表达 生物学特性 |
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