嗜热杜邦菌α-淀粉酶的定向进化及高效表达

目的:对嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶进行分子改造，以提高其耐热性和产酶水平。方法:基于易错PCR技术构建嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶（Td-amy）的随机突变文库，高通量筛选耐热性和比酶活提高的突变体，通过定点突变及同源结构模拟对突变体进行分析，并将其在毕赤酵母中表达。结果:筛选得到一个正向突变体（mTd-amy）。该突变体最适温度（60 ℃）较野生型（55 ℃）提高了5 ℃，比酶活（466.3 U/mg）较野生型（227.9 U/mg）提高至2.0倍。经序列对比，mTd-amy有四个氨基酸发生了变化，分别为Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg和Ala468Asp，定点突变结果表明Ala122Val和Ala468Asp位点为影响其比酶活和最适反应温度的关键。进一步将突变体mTd-amy在毕赤酵母中高效表达，经高密度发酵其酶活达64696 U/mL。结论:定向进化获得了嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶的正向突变体，该突变体的最适温度和比酶活力均明显提高，为α-淀粉酶的分子改造以及工业化应用等提供了理论参考。