基于CRISPR/Cas9系统的金针菇基因组编辑载体构建

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9,构建金针菇基因Mads-8敲除载体及转化体系。以转录组数据为依据,通过分析基因Mads-8序列信息,选择高效的靶位点序列,同时加入筛选标记基因hph构建过渡载体sgRNA-T,通过菌落PCR鉴定和测序来验证靶位点序列是否正确插入。以表达载体pg Fvs-cas9为框架,酶切连接后构建重组敲除载体pg Fvs-Cas9-gRNA,PCR和酶切鉴定敲除载体。再以PEG介导的金针菇原生质体转化表达载体,在潮霉素抗性平板上筛选拟转化子,以拟转化子基因组DNA为模板扩增Cas9基因。结果显示,靶位点序列成功插入敲除载体且序列正确,重组质粒成功转化进金针菇的基因组。对金针菇基因组敲除载体的构建,为后续金针菇相关基因的功能验证及育种研究提供载体材料及理论依据。