副猪嗜血杆菌外膜蛋白pilA基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达副猪嗜血杆菌菌毛蛋白pilaA基因.[方法]对已发表的HPS的pilA序列进行分析;合成引物,并以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS的pilA编码基因,获得目的基因片段;构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达至大肠杆菌BI21(DE3)中,进行SDS-PAGE与Western blot检测.[结果]表达的重组蛋白分子质量与预期的43 kD一致.[结论]该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础.     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析

[目的]探讨2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系.[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析.[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%.2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,均为H9N2低致病力禽流感病毒.[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物.     

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法.[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫,提取卵囊基因组DNA.根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18S rDNA和5.8S rDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1(ITS-1),PCR产物直接测序.[结果]成功分离出肠艾美尔球虫,PCR扩增出434 bp清晰条带,且最低能检测出27个孢子化卵囊 .[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础.     

固原鸡线粒体基因组ATPase 8基因的克隆及序列分析

[目的]扩增固原鸡(白羽、麻羽、红羽)、肉鸡品种AA鸡及蛋用品种罗曼鸡线粒体ATPase 8(ATP酶第8亚基)基因.[方法]从鸡血液中提取基因组DNA.然后,利用已经公布的鉴别检测鸡的源性成分的特异性引物,PCR扩增线粒体ATPase 8基因并测序.[结果]固原鸡不同品系和AA鸡的ATPase 8基因全序列为165 bp,罗曼鸡为168 bp.[结论]不同品系固原鸡的ATPase 8基因序列与罗曼鸡和AA肉鸡均有较高的同源性,但是与鹌鹑、鹧鸪、鸵鸟、鹅、火鸡的同源性相对较差.     

野大麦盐胁迫rbcS基因的克隆及序列分析

[目的]对野大麦盐胁迫rbcS基因进行克隆及序列分析.[方法]以盐胁迫下的野大麦幼嫩叶片为试材,根据GenBank中小麦和大麦rbcS基因核酸序列的同源性设计引物,对野大麦基因组DNA进行PCR扩增、回收、连接、转化及测序.[结果]在野大麦的基因组中克隆了2个大小不同的rbcS基因序列rbcS1和rbcS2,长度分别为1 252和908 bp.rbcS1和rbcS2均由2个外显子和1个内含子组成,外显子长度相等,编码序列为525 bp,同源性为96%,编码174个氨基酸;rbcS1和rbcS2内含子大小不同,分别为448 和107 bp.[结论]为进一步探讨rbcS基因在野大麦耐盐机制中的分子机制奠定了基础.     

副猪嗜血杆菌EZ-Tn5转座子插入突变体库的构建及减毒株的筛选

[目的]获得副猪嗜血杆菌减毒株.[方法]应用转座子技术构建转座子插入突变体库,卡那抗性筛选阳性菌株,PCR扩增卡那特异片段去除假阳性,小鼠感染试验检测突变株毒力,并对获得的减毒株进行生物学特性检测.[结果]所获得减毒突变菌株具有与野毒株相似的增殖能力,传代后毒力稳定,遗传学特性稳定.[结论]该研究结果为进一步探讨HPS毒力因子、致病机制奠定了基础.     

观音土曲乳酸菌的分离与分子鉴定

[目的]指导白酒生产,提高白酒质量.[方法]采用平板分离法从观音土曲中分离到7株乳酸菌(B1～B7),测定其发酵产乳酸的量.选取乳酸产量最高的1株菌B7,提取其DNA并进行16S rDNA的PCR扩增、克隆、测序.从GenBank中选取与B7同源性最高的典型菌株,下载其16S rDNA序列,采用邻位相连法构建进化树.[结果] B1～B7的产乳酸量分别为:24.7、20.7、30.7、15.2、9.5、21.8、35.7 mg/100ml;对B7的基因组DNA进行16S rDNA的PCR扩增,并对纯化后的扩增产物进行TA克隆,阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳后在3 000和1 600 bp处出现电泳条带,说明B7的16S rDNA PCR扩增产物已克隆到测序载体上.同源性分析结果表明,B7为乳杆菌属的短乳杆菌.[结论]该研究从观音土曲中分离到1株高产乳酸菌--短乳杆菌.     

暗紫红毛菜ITS序列的测定与分析

[目的]对暗紫红毛菜rDNA内转录间隔区(ITS区)进行序列测定,为其系统发育研究提供新资料.[方法]以产于山西娘子关泉的一株暗紫红毛菜为材料,提取DNA,设计引物,进行PCR扩增,进而测定其ITS区基因序列.[结果]暗紫红毛菜与同科的少精紫菜ITS区同源性为75%,与条斑紫菜ITS区同源性为79%.[结论]ITS区序列进化速率相对较快,种类和地理分布的差异是其序列差异产生的原因.     

1株出芽短梗霉的分离·纯化及鉴定

[目的]为出芽短梗霉的进一步开发利用提供理论依据.[方法]采用平板稀释法从土壤中分离出1株出芽短梗霉,用YPD培养基培养菌丝体,显微成像获得菌丝微观形态,利用分子生物学方法对其rRNA基因内转录区段(ITS 区)进行克隆测序,并与Genbank中已知序列进行比较.[结果]ITS区PCR扩增产物测序结果表明,所扩增序列的长度为606 bp,与Genbank中短梗霉的同源率为98%～99%,与Aureobasidium pullulans wb 149、A.pullulans HK58-1(2)属于同一单独分枝;形态及分子鉴定结果表明,出芽短梗霉培养成功.[结论]该研究采用经典与现代分子技术相结合的方法鉴定出了1株出芽短梗霉,为出芽短梗霉的分类鉴定提供了依据.     

高简并引物小温度范围不规则降落PCR在庞大基因家族扩增中的应用

[目的]探讨高简并性引物扩增庞大基因家族基因的特殊方法.[方法]采用高简并引物对鲤鱼基因组DNA分别进行了常规PCR扩增、常规降落PCR扩增以及优化后的小温度范围不规则跳跃降落PCR扩增.[结果]采用常规PCR仅得1条明显条带,得到的基因较少;采用常规降落PCR仅得到弥散性扩增,无明显条带出现;而采用小温度范围不规则跳跃降落PCR则得到了3条明显条带和多个基因,扩增结果理想.[结论]为庞大基因家族扩增条件的优化与选择提供了理论依据.