重组戊型肝炎p179疫苗小鼠抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用

目的建立重组戊型肝炎p179疫苗抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。方法确定重组戊型肝炎疫苗p179抗原的最佳包被浓度及包被条件、酶标抗体的最佳稀释度、封闭条件、最佳抗体稀释液,对建立的方法的特异性、准确性及精密度进行验证,并与市售ELISA试剂盒进行比较。结果抗原最佳包被浓度为1μg/ml,4℃包被过夜;酶标抗体最佳稀释度为1∶5 000;3%牛血清白蛋白封闭3 h;最佳抗体稀释液为含1%酪蛋白PBS。建立的方法检测的A450与重组戊肝抗原浓度呈明显的剂量依赖性,对不相关的anti-HAV、anti-HB、anti-INF、anti-RABV无交叉反应;36份小鼠阳性血清的检出率为100%;3份阳性血清重复检测20次的CV均小于15%。市售某厂家ELISA试剂盒检测48份血清,阳性检出率为83.3%,建立的间接ELISA方法检测,阳性检出率为89.6%。结论建立了重组戊肝p179疫苗抗体间接ELISA检测方法,可用于重组戊肝疫苗小鼠免疫后血清抗体的检测。     

单抗制品中CHO细胞宿主蛋白残留双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的建立单抗制品中CHO细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留双抗夹心ELISA检测方法。方法确定双抗夹心ELISA方法的最佳工作条件,并对该方法的精密度和准确度进行验证,确定线性范围及最低检出限;用建立的方法与市售试剂盒分别检测低、中、高浓度HCP标准品及抗TNF-α单抗原液、抗VEGF单抗纯化工艺样品中的HCP。结果建立的双抗夹心ELISA法最佳抗体包被浓度为1.5μg/ml,酶标抗体浓度为1μg/ml,160 r/min,37℃孵育2.5 h;TMB 37℃孵育15 min;以630 nm为参比波长,450 nm为测定波长。该方法的线性范围为3.125~100 ng/ml,最低检测限为3.125 ng/ml;试验内变异系数(CV)和试验间CV均小于15%,回收率为85.3%~115.1%。与商品化试剂盒检测结果基本一致,可用于检测纯化工艺样品。结论已成功建立单抗制品中CHO细胞HCP残留双抗夹心ELISA检测方法,该方法可代替市售试剂盒用于CHO细胞HCP残留检测,可使检测成本降低30倍。     

O型口蹄疫病毒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立及验证

目的建立O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用O型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法。对方法的抗原包被浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h、37℃2.5 h、37℃3 h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10000~1∶20000稀释)、封闭液种类(不封闭、1%BSA封闭、2%BSA封闭、5%脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(10、15、20、25、30 min)进行优化。同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性。采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清,计算两者的符合率。结果方法最适检测条件为:抗原包被浓度0.5μg/mL,抗原包被温度及时间为4℃过夜,血清稀释度为1∶4;HRP-IgG稀释度为1∶18000;封闭液为1%BSA,封闭液作用时间为30 min;HRP-IgG与血清作用时间为30 min;底物作用时间为10 min。21份不同猪病的阳性血清中,除3份O型FMD阳性血清为阳性外,其他血清样品为阴性,该方法无交叉反应;敏感性为90.4%,特异性为95.7%;批内和批间精密性试验变异系数(CV)均<10%。该方法与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率为97%。结论建立的方法具有良好的特异性及精密性,且操作简便,可用于O型FMDV血清抗体的检测。     

西尼罗病毒抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及其应用

目的建立及验证西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)抗体间接ELISA检测方法,并用于评价疫苗的免疫效果。方法以纯化后的WNV E蛋白第三结构域(EDⅢ)蛋白作为包被抗原,建立WNV抗体间接ELISA检测方法,对抗原包被浓度(2.5、5、10、20、40、80μg/ml)、血清稀释度(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320)、抗原封闭时间(0.5、1、1.5、2 h)、血清孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)、HRP标记的山羊抗马Ig G稀释倍数(1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:40 000、1:80 000稀释)及其孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)进行优化,并验证该方法的特异性、敏感性及精密性。采用建立的方法检测WNV阴性马血清和病毒样颗粒(WNV-VLPs)疫苗免疫的马血清,与ALPHA公司试剂盒的检测结果进行比较。结果间接ELISA法最佳检测条件为:抗原包被浓度为20μg/ml,4℃包被过夜;Blocking ACE封闭液于37℃封闭1.5 h;加入血清(1:80稀释),37℃孵育1.5 h;加入HRP标记的山羊抗马Ig G(1:20 000稀释),37℃孵育1 h。该方法可特异性检测WNV阳性血清中的WNVE-Ig G抗体;阳性血清稀释至1:2 560时,检测结果仍为阳性;批内和批间的变异系数(CV)均小于7%。25份WNV阴性马血清检测结果均为WNVE-Ig G抗体阴性,经WNV-VLPs疫苗免疫的马血清中的WNVE-Ig G抗体效价水平随免疫次数的增加呈递增趋势,间接ELISA法与ALPHA公司试剂盒的检测结果完全一致。结论成功建立了WNV抗体间接ELISA检测方法,可用于疫苗免疫效果的评价,为开展WNV流行病学调查、诊断及新型疫苗的研发奠定了基础。     

检测疫苗残余牛血清ELISA试剂的质量控制

目的　检测疫苗残余牛血清ELISA试剂的质量控制。方法　将用于生产的 10批牛血清混合后 ,免疫家兔制备抗血清 ,以纯化抗牛血清兔IgG作为包被抗体、HRP 酶标抗体作为指标抗体 ,采用ELISA双抗体夹心法进行线性范围、精密度、准确度、特异性评价等一系列检测。结果　兔抗牛免疫血清双扩效价可达 1∶16 ,免疫血清、纯化抗体和酶标抗体均含有抗牛血清白蛋白及牛IgG等多种蛋白成分的抗体 ;检测疫苗中残余牛血清含量最佳线性范围为 0 78～ 2 5ng/ml,精密度 (回收率为 80 %～ 112 . 5 % ,CV为 2 . 5 %～ 9 0 % )和准确度 (回收率为 96 . 7%～112 . 5 % ,CV为 1. 4 %～ 9 .4 % )良好 ,检测限度为 1 5ng/ml,检测限量为 3ng/ml;与正常马、兔、豚鼠血清以及不同病毒性疫苗基质液均无交叉反应 ,可定量检测不同病毒性疫苗中的残余牛血清。结论　所制备的ELISA试剂特异性强 ,灵敏度高 ,重复性好 ,适用于常规疫苗中残余牛血清的检测。     

流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体间接ELISA检测方法的优化及其实验室内控品的制备

目的优化流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,并制备IgA抗体实验室内控品。方法采用ELISA检测法对流感病毒抗原(全病毒及其相应HA抗原)及包被浓度(0. 5、1、2、4μg/mL)、封闭液(1%BSA、10%FBS、5%脱脂奶粉)及封闭时间(1、1. 5、2 h)、样本稀释液(含1%BSA的PBST、含2%脱脂奶粉的PBST、样本保存液)及样本作用时间(45、60、75 min)、酶标抗体稀释度(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000)进行优化。采用优化的方法制备针对H1N1、H3N2和B型3个型别流感病毒的IgA抗体检测用实验内控品,并用该方法对接种三价流感减毒活疫苗的20名志愿者的鼻咽拭子样本进行检测。结果最适间接ELISA法检测条件为:以全病毒作为包被抗原,包被浓度为1μg/mL;以含1%牛血清白蛋白为封闭液封闭2 h;样本稀释液为2%脱脂奶粉的PBST,作用时间为60 min;酶标抗体稀释度为1∶1 000。采用优化方法制备的H1N1、H3N2、B型IgA抗体阳性实验室内控品几何平均滴度分别为23、45、35,可接受范围分别为16～32、32～64、32～64。接种疫苗后20名志愿者中3种型别IgA抗体滴度较接种前均显著增高(P 0. 001),40%～50%志愿者接种后IgA抗体滴度比接种前至少升高2倍。结论成功优化了流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,制备的IgA抗体的实验室内控品可用于流感减毒活疫苗接种后鼻咽拭子抗体的检测。     

基于人工多表位抗原的恶性疟疾抗血清筛查方法的建立

目的建立基于人工多表位抗原的恶性疟疾抗血清筛查方法。方法以人工多表位抗原M.RCAg-1(malaria random constructed antigen-1)和M.RCAg-3(malaria random constructed antigen-3)作为检测蛋白,建立间接ELISA法和双抗原夹心ELISA法,并对两种方法的抗原包被量、一抗稀释度、封闭液、孵育时间及显色时间进行优化。用两种方法检测恶性疟疾病人和正常人血清抗体水平,比较其敏感度,选出最佳检测方法,并检验其特异性和精密性。结果间接ELISA法最佳检测条件:以0.1μg/孔浓度的抗原包被酶标板120 min,用3%羊血清封闭120 min,加入一抗(1∶200稀释)孵育120 min,加入二抗(1∶20 000稀释)孵育60 min,TMB显色10 min;双抗原夹心ELISA法最佳检测条件:一抗稀释度为1∶20,二抗稀释度为1∶100,其他同间接ELISA法。经敏感性比较,确定以M.RCAg-1为抗原的间接ELISA法为最佳检测方法,且该抗原对间日疟血清抗体无明显交叉反应,该方法的批内和批间精密性试验变异系数(CV)为3.05%~5.82%和4.75%~8.54%,均10%。结论单独包被M.RCAg-1的间接ELISA法的检出率高,特异性和精密性良好,操作简便,可用于疫区恶性疟疾的血清流行病学筛查。     

包被伤寒Vi多糖抗原检测鼠血清中伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法的建立

目的建立检测伤寒沙门菌(Salmonella typhi)抗体的间接ELISA方法,并进行验证。方法对常规间接ELISA方法进行优化,确定抗原最适包被质量浓度及被检血清最佳稀释度、最适包被温度及时间、包被抗原与血清的最适温度和时间、血清与酶标二抗及封闭的最适温度和时间、酶标二抗最适工作质量浓度,并验证该方法的灵敏度、精密性、特异性及耐用性;用伤寒Vi多糖结合物原液和伤寒Vi多糖衍生物经小鼠大腿内侧皮下免疫,分别于免疫后第14、21、28、35天,经眼眶采全血,分离血清,应用建立的间接ELISA方法检测抗体水平,计算抗体几何平均滴度(GMT)。结果确定了间接ELISA方法最适工作条件:伤寒Vi荚膜多糖抗原最适包被质量浓度为5μg/ml,血清最佳稀释倍数为1∶40;最适包被温度及时间为4℃12 h;包被抗原与血清最适反应温度和时间为37℃2 h;血清与酶标二抗最适反应温度和时间为37℃1 h;封闭液最适封闭温度和时间为室温1 h;HRP标记的羊抗鼠IgG最佳反应浓度为1∶8 000。该方法灵敏度为1∶1 600;孔间和板间CV平均值分别为2.8%和5.8%;与其他血清无交叉反应;pH值、包被时间、包被温度及酶结合时间调整前后,同一样品检测的A450值差异无统计学意义(P0.05)。伤寒Vi多糖与蛋白载体偶联后,免疫原性明显增强,且白喉类毒素(diphtheria toxin DT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinantPseudomonasaeruginosaexotoxinA,rEPA)两种不同载体偶联得到的结合物免疫原性无明显差异。结论成功建立了一种检测伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法,该方法具有较强的特异性、灵敏度及精密性。     

猪弓形虫循环抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立一种检测猪血清中弓形虫循环抗原(circulating antigen,CAg)的双抗体夹心ELISA法。方法利用抗弓形虫表面抗原3(surface antigen 3,SAG3)的单克隆抗体Anti-A-SAG3-7作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗弓形虫SAG3的单克隆抗体Anti-A-SAG3-23作为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,并对方法的捕获抗体(1∶400~1∶6 400倍比稀释)、检测抗体(1∶400~1∶12 800倍比稀释)、血清稀释度(1∶10~1∶80倍比稀释)及封闭液的种类(5%脱脂奶粉、10%胎牛血清、5%BSA、1%BSA)进行优化,同时验证该方法的敏感性、特异性及精密性。采用优化后的方法对广东和吉林地区的各94份猪血清样本进行检测。结果双抗体夹心ELISA法的最佳检测条件为:捕获抗体Anti-A-SAG3-7及检测抗体HRP-Anti-A-SAG3-23稀释度均为1∶3 200,封闭液为1%BSA,血清稀释度为1∶80。该方法检测两份猪囊虫阳性血清无交叉反应,灵敏度达1∶640,批内及批间的变异系数(CV)均11%。广东和吉林地区各94份样品的阳性率分别为20.2%(19/94)和11.7%(11/94)。结论该方法具有良好的特异性、敏感性及精密性,可用于猪弓形虫CAg的检测。     

鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒的研制

目的研制鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证。方法用纯化的鼠疫菌F1抗原作为包被抗原,HRP标记的F1抗原作为酶标抗原,建立鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品。对试剂盒进行板内板间精密性、敏感性、特异性、准确性和稳定性验证。结果鼠疫菌F1抗原的最佳包被浓度为0.6μg/ml,HRP标记的F1抗原的最佳工作浓度为1︰7 000。制备的试剂盒检测精密性质控品的板内变异系数为6.5%,板间变异系数为7.1%;检测高、中、低浓度内部质控品和精密性质控品的回收率在95%¹12%之间;检测阳性血清和阴性血清的敏感性为100%;与正常人血清、正常兔血清、正常小鼠血清、兔抗假结核耶尔森菌血清、小鼠抗假结核耶尔森菌血清均无交叉反应;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年。结论成功制备了鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,达到了体外诊断试剂的注册要求,可用于鼠疫的临床监测、诊断及预后判断。