轮状病毒UK株NSP1蛋白对人源宿主细胞干扰素调节因子3的影响

目的探讨轮状病毒UK株NSP1蛋白对人源宿主细胞干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的影响。方法将UK毒株感染人结肠腺癌细胞Caco-2 6、12、24 h后,通过实时定量PCR和Western blot检测细胞内源性IRF3在转录水平和蛋白水平的变化;构建质粒pCMV-3×FLAG-UK-NSP1和缺失IRF3结合结构域的质粒pCMV-3×FLAG-UK-NSP1△IRF3,分别单独转染及与p EGFP-N3-IRF3质粒共转染293T细胞4、8、12 h后,Western blot分析IRF3蛋白含量的变化。结果 IRF3 m RNA转录水平无明显变化,UK毒株感染组和NSP1质粒转染组IRF3蛋白含量均下降。结论 UK-NSP1能够介导人IRF3蛋白降解,且需要IRF3结合结构域参与。     

猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株截短VP8基因的原核表达、蛋白纯化及免疫原性分析

目的原核表达猪轮状病毒(porcine rotavirus,PRV)Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化重组蛋白,并检测其免疫原性。方法经PCR从含有全长VP4基因片段的重组质粒pCR4-Gottfried VP4和pCR4-SB-1A VP4中分别扩增截短的VP8*基因(△VP8*,64～223位氨基酸),分别插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Gottfried-△VP8*和pET-28a-SB-1A-△VP8*,分别转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。应用ProBondTMResin纯化两种重组蛋白,重组蛋白与A(lOH)3佐剂混合后,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果两种重组表达质粒经双酶切和测序证实构建正确;表达的两种目的蛋白相对分子质量约25 000,均以包涵体和可溶性两种形式存在,均可与鼠源抗Histag单克隆抗体特异性结合;纯化的两种重组蛋白纯度均在95%以上,免疫BALB/c小鼠可产生较高的血清抗体水平。结论成功在大肠埃希菌中表达了PRV Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化的两种蛋白免疫原性较好,为进一步研制安全、高效的PRV亚单位疫苗奠定了基础。     

牛副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白在杆状病毒中的表达

目的在杆状病毒中表达牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type-3,BPIV-3)血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN)。方法提取BPIV-3 BN-1株RNA,设计特异性引物扩增HN全长ORF,将其克隆至杆状病毒供体载体p Fast Bac HTA中,获得重组供体质粒p Fast Bac-HN。将p Fast Bac-HN转化至感受态细胞E.coli DH10Bac,制备穿梭质粒Bacmid-HN。将纯化的Bacmid-HN经脂质体转染至Sf21昆虫细胞,拯救重组杆状病毒,并进行Western blot鉴定。结果经PCR及测序鉴定证明,HN基因重组供体质粒p Fast Bac-HN及穿梭质粒Bacmid-HN构建正确。利用Sf21昆虫细胞成功拯救重组杆状病毒,连续传代扩增3代的病毒滴度为2×108 CPE/ml。重组HN蛋白的相对分子质量约70 000,可与BPIV-3阳性血清发生特异性反应。结论在杆状病毒表达系统中成功表达了BPIV-3重组HN蛋白,为BPIV-3的诊断及疫苗效力评价奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立及验证

目的建立O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用O型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法。对方法的抗原包被浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h、37℃2.5 h、37℃3 h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10000~1∶20000稀释)、封闭液种类(不封闭、1%BSA封闭、2%BSA封闭、5%脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(10、15、20、25、30 min)进行优化。同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性。采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清,计算两者的符合率。结果方法最适检测条件为:抗原包被浓度0.5μg/mL,抗原包被温度及时间为4℃过夜,血清稀释度为1∶4;HRP-IgG稀释度为1∶18000;封闭液为1%BSA,封闭液作用时间为30 min;HRP-IgG与血清作用时间为30 min;底物作用时间为10 min。21份不同猪病的阳性血清中,除3份O型FMD阳性血清为阳性外,其他血清样品为阴性,该方法无交叉反应;敏感性为90.4%,特异性为95.7%;批内和批间精密性试验变异系数(CV)均<10%。该方法与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率为97%。结论建立的方法具有良好的特异性及精密性,且操作简便,可用于O型FMDV血清抗体的检测。     

基于轮状病毒VP6蛋白新型候选疫苗的研发进展

轮状病毒(rotavirus,RV)是一种人畜共患病原体,给畜牧业和人类健康带来巨大威胁。对RV感染的治疗,目前尚无有效药物,接种疫苗是有效防控RV性胃肠炎暴发的重要措施。目前人商品化RV疫苗均为口服减毒活疫苗,存在散毒风险及潜在安全性等问题,且该疫苗在不发达国家的免疫效力较低,因此,非复制型疫苗很可能成为主要的候选疫苗。本文以RV结构蛋白VP6为基础,对该蛋白在RV免疫应答中的作用及其在RV非复制型疫苗的研发及防治中的应用作一综述。     

阳离子PLGA纳米颗粒作为核酸疫苗递送载体的能力及其特性评价

目的对阳离子聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA]纳米颗粒作为核酸疫苗载体的能力及其特性进行评价。方法采用双重乳化法制备阳离子PLGA纳米颗粒,检测其粒径分布和表面电势,获得合成的最适方案。通过考察其形貌、吸附效率、抵抗核酸酶降解能力、细胞毒性、细胞摄取及转染真核表达质粒的能力,分析其作为核酸疫苗载体的适用性及可行性。结果由两种试剂修饰PLGA制备的纳米颗粒粒径分布、表面电势及分散性最佳;透射电镜及扫描电镜下观察粒径均一且呈规则球形;对质粒DNA的吸附效率可达65%;能够有效保护吸附于纳米颗粒的质粒DNA免受核酸酶降解;两种细胞系中的细胞毒性试验均显示细胞存活率高于80%;共聚焦显微镜下可观察到其能被细胞内化;间接免疫荧光试验结果表明,其能有效转染真核表达质粒并使其正确表达。结论成功制备了具有递送核酸疫苗能力的阳离子PLGA纳米颗粒,为核酸疫苗载体的发展奠定了理论基础。