军团菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种特异、快速、敏感,同时能区分嗜肺和非嗜肺军团菌的荧光定量PCR方法,用于检测临床和环境样品。方法利用军团菌属特异性23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因的保守序列,设计引物和TaqMan探针。提取嗜肺军团菌标准菌株(LP1)DNA,分别构建2个含有目的基因的标准质粒作为阳性模板。优化荧光PCR反应条件和反应体系,对方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。并对环境水样及80份临床痰样进行检测。结果该方法检测灵敏度达10标准质粒拷贝数/反应,具有高度特异性、稳定性。整个过程约需2 h。对35份环境水样进行检测,检出3株嗜肺军团菌和3株非嗜肺军团菌,所有水样经传统分离培养法和普通PCR法检测均显示为阴性。对临床80份随机痰液标本进行检测,2份嗜肺军团菌阳性。结论 TaqMan探针荧光定量PCR双管检测是一种可同时区分嗜肺与非嗜肺军团菌的特异、敏感、稳定的方法,可用于基层医院对环境标本及临床痰样的检测。     

分子探针-酶联夹心杂交法测定水中微囊藻

微囊藻是分布最广的一类水华蓝藻,研究、建立微囊藻的快速检测方法具有十分重要的意义.针对藻蓝蛋白的基因间隔区域序列设计了一组可用于检测微囊藻种属的特异性探针,以实验室培养的微囊藻Microcystis aeruginosa为研究对象,建立了一种检测微囊藻的夹心杂交法.将该法用于华中科技大学校园内的景观湖——镜湖水样的检测,结果与显微镜观察和全细胞PCR的结果一致,表明试验建立的方法是有效的.     

HS/SPME/GC/MS检测藻细胞内致嗅物的前处理方法

藻源致嗅物质引起的水体嗅味是高藻源水环境的重要问题,其定量检测难度高,特别是胞内致嗅物质的检测容易出现误差。建立了顶空固相微萃取与气相色谱质谱联用技术(HS/SPME/GC/MS)同时定量检测水中5种典型藻源致嗅物质β-环柠檬醛、β-紫罗兰酮、二甲基三硫醚、2-甲基异莰醇和土臭素的方法,各物质标准曲线的线性关系良好(R20.99),检测限显著低于其嗅阈值,回收率为92.60%~113.70%,相对标准偏差(RSD)≤5.92%。以铜绿微囊藻为例,建立了用于胞内致嗅物质检测的加热盐浴前处理方法。采用密封萃取瓶内加热盐浴处理藻液,检测藻液中致嗅物质总含量,以总含量与经0.45μm滤膜过滤后胞外含量的差值作为胞内含量。流式细胞技术检测表明,HS/SPME预热3 min内,破胞率超过99%。激光粒度仪检测发现藻细胞以穿孔方式破胞同时细胞尺寸未发生明显变化。加热盐浴差值法简化了操作,缩短了破胞处理时间,密封环境下破胞降低挥发损失,从而保证了胞内致嗅物质检测的准确性。     

产色头孢菌素法检测淋病奈瑟菌β-内酰胺酶的临床应用评价

目的评价产色头孢菌素法检测淋病奈瑟菌β-内酰胺酶的临床应用效果。方法采用产色头孢菌素法常规检测淋病奈瑟菌临床分离株的β-内酰胺酶;同时采用纸片酸度定量法将保存的上述淋病奈瑟菌菌株进行β-内酰胺酶检测,与产色头孢菌素法检测结果不一致者采用PCR方法检测淋病奈瑟菌的β-内酰胺酶基因,以两种方法结果一致者为真结果,对产色头孢菌素法检测的结果进行评价。结果检测74株淋病奈瑟菌分离株,产色头孢菌素法阳性28株,阳性率37.8%;纸片酸度定量法阳性25株,阳性率33.8%;两种方法结果一致者69株,一致率93.2%,5株结果不一致菌株中,其中1株纸片酸度法阳性,产色头孢菌素法为阴性,但β-内酰胺酶基因阳性,4株产色头孢菌素法为阳性,纸片酸度法和β-内酰胺酶基因均为阴性,74株淋病奈瑟菌的β-内酰胺酶基因阳性25例,产色头孢菌素法敏感性96%,特异性91.8%。结论产色头孢菌素法操作简便,敏感性高,适合临床筛查淋病奈瑟菌的β-内酰胺酶。     

饮用水嗅味物质检测与控制技术研究进展

介绍了我国饮用水中的主要嗅味问题及其来源,总结了致嗅物质的组成与分类,并重点探讨了饮用水中嗅味物质的检测与控制技术。水中嗅味物质的检测方法主要包括感官分析、仪器分析及综合分析。其中,嗅味层次分析法是最常用的感官分析法;仪器分析中更加注重对水样的预处理技术,固相萃取是一种有效的水样预处理技术。典型致嗅物质的去除工艺主要包括活性炭吸附法、化学氧化法、生物处理法及联合法。通过介绍分析近10年的研究发现,我国需要尽快开展饮用水中致嗅物质的标准化检测方法及典型致嗅物质控制技术的研究,以形成应对不同水源、不同季节、不同致嗅物质的饮用水处理工艺,以保障饮用水安全。     

预氧化强化混凝去除颤藻及其嗅味研究

研究了高锰酸钾复合药剂(PPC)预氧化与预氯化联用对含颤藻水样及由其引起嗅味的混凝处理效果，并与单纯预氯化、高锰酸钾预氧化、复合药剂预氧化、高锰酸钾预氧化与预氧化联用以及单纯混凝的处理效果进行了对比。结果表明，单纯混凝及单纯高锰酸钾预氧化对颤藻及其引起的嗅味去除效果很差；单纯预氯化及高锰酸钾预氧化与预氯化联用除藻效果尚可，但对嗅味不仅未去除反而有所增强；而PPC预氧化及其与预氯化联用除藻、除嗅味效果均较好，采用PPC预氧化与预氯化联用方式处理效果更佳。     

富营养化湖泊水源生物预处理研究

生物预处理法对富营养化含藻湖泊水源的处理是一种有效方法。研究结果表明;水温、气水比、藻负荷以及藻的种类等,是影响藻类去除的主要因素;通过该法预处理对藻类、氨氮、浊度、色度、嗅阈值和COD_(M(?)等都具有明显的去除效果,处理后的水质得到全面改善,处理效果稳定,产泥量少且易于脱水干化。     

碳氮比对生物膜SND过程微生物菌群结构的影响

将传统水质检测方法和荧光定量PCR技术相结合,以序批式生物膜反应器(SBBR)为研究对象,选取总细菌、氨氧化菌(AOB)、硝化菌(NOB)和反硝化菌4种目的基因,对各菌群的特征形态进行表达,分析在不同碳氮比条件下生物膜不同微区各功能菌群的结构变化。结果发现,碳氮比对氨氮和总氮去除效果有明显影响。水质分析结果表明,当C/N值分别为4、6、8、10、12时,对氨氮的平均去除率分别为73.64%、77.85%、87.27%、90.20%、85.42%,对总氮的平均去除率分别为47.96%、57.34%、81.26%、87.03%、75.76%。荧光定量PCR结果表明,当C/N值分别为8、10、12时,AOB的平均拷贝数分别为2.50×107、3.08×107、7.85×106copies/ng;NOB的平均拷贝数分别为2.17×105、4.19×105、1.48×105copies/ng。由水质检测和定量PCR综合分析,当碳氮比为10时SBBR的脱氮效果最佳。     

嗅味层次分析法对饮用水中嗅味的识别

介绍了嗅味层次分析法（FPA）培训程序及其在饮用水嗅味识别中的应用案例。结果表明，按照FPA方法选择并培训的测试小组，对于实际水样中的异嗅味能够进行明确的定性和定量分析；FPA小组经嗅阈值及强度训练后，对典型土霉味物质（2-甲基异莰醇，MIB）和氯味物质NaClO的嗅阈值可分别达到4．82ng／L和0．03mg／L，同时检测出的嗅味强度与嗅味物质浓度间的关系符合Weber—Fechner Law关系式（R^2分别为0．97、0．99），且具有较好的重现性。采用该方法测定了北方某水厂各工艺段水样的嗅味变化情况。结果表明，FPA法可较好地用于评价水厂工艺对常见嗅味物质的处理效果，能够为水厂的运行提供可靠的感官分析手段。     

禾谷镰刀菌Homeobox转录因子FgHtf1敲除突变体基因差异表达分析

禾谷镰刀菌是引起小麦赤霉病的主要病原真菌。分生孢子在侵染过程中起关键作用。先前研究表明同源异型盒(Homeobox)转录因子FgHtf1特异调控分生孢子的产生。为明确其调控产孢的分子机制,本研究采用高通量RNA测序技术(RNA-Seq),对ΔFghtf1突变体菌株和野生型PH-1菌株进行测序,结果显示其中591个基因转录上调,549个基因下调。对这些基因进行功能预测并聚类分析发现:上下调基因中分别有约30%和22%参与新陈代谢和能量转运。运用荧光定量PCR,检测10个基因的表达,验证了RNA-Seq的结果是可靠的。运用同源重组方法敲除明显下调的基因FGSG_10565和FGSG_07629,表型分析结果显示,相比野生型,ΔFGSG_10565和ΔFGSG_07629的生长速率和产孢量均不变,说明两个基因的表达受FgHtf1调控,但功能上不直接参与分生孢子的形成。     

肠道杆菌耐药基因的研究

目的检测肠道杆菌对抗菌药物的敏感性及其耐药基因。方法选取16株临床分离的肠道杆菌,用纸片扩散法检测其对14种抗菌药物的敏感性。PCR法检测TEM型β-内酰胺酶基因、DHA和ACT-1型AmpC酶基因、aac（6’）-Ib型氨基糖苷类修饰酶基因、qacE△I-sull耐消毒剂和磺胺基因。结果多重耐药菌对氨苄西林、哌拉西林、头孢噻吩全部耐药,其余药物显示不同程度的耐药。TEM型β-内酰胺酶基因检测均为阳性。对卡那霉素耐药的志贺菌和大肠埃希菌aac（6’）-Ib基因检测阳性,大肠埃希菌qacE△-sull基因检测均为阳性而志贺菌均为阴性。AmpC酶基因检测结果有2株菌ACT-1阳性而DHA全阴。结论多重耐药细菌存在多种耐药基因。     

TREM2基因与中国福建阿尔茨海默病患者相关性分析

目的:探讨TREM2基因与中国福建阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者的关联性。方法:纳入中国福建地区106例AD患者(AD组)和120例健康对照者(健康对照组),提取其外周血白细胞DNA和RNA,运用Sanger测序方法检测TREM2基因R47H变异,同时利用实时荧光定量PCR方法检测m RNA表达水平,分析TREM2基因与AD的相关性。结果:AD组与健康对照组TREM2基因R47H变异比较,差异无统计学意义(P>0.05),同时两组人群TREM2基因m RNA水平相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:TREM2基因可能与中国福建AD患者无明显相关性。     

产肠毒性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用

双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide,DPO)是一种新型的引物设计方法,具有设计简易、特异性强以及退火温度范围宽的特点。以产肠毒性大肠杆菌LT基因为靶基因,设计了一对DPO引物,经过对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP反应体系因子的优化,建立了产肠毒性大肠杆菌DPO-PCR检测方法,测定了该方法的灵敏度、特异性以及退火温度不敏感性。结果显示,该方法检测灵敏度为1.24×102CFU/ml,在45℃⁶5℃退火温度范围内,均可实现靶基因的高效扩增。该方法特异性强,测试菌株中4株产肠毒性大肠杆菌均为阳性结果,其余菌株为阴性结果,且无非特异性扩增发生。与常规PCR方法相比,DPO-PCR方法不需要对引物参数特别是退火温度反复优化,同时DPO引物的特殊结构又增强了检测特异性,为致病性微生物的快速准确检测提供了新方法。     

溶藻系统中微生物的群落结构研究

从藻类消退期的河流中取水样,分别加入斜生栅藻、铜绿微囊藻、小球藻、人工湖泊中的两种混合野生藻及氧化塘中的野生藻,平行培养1周,考察水样中的溶藻细菌对这些藻类的去除效果.结果表明,对上述水样中的叶绿素a的去除率分别为94.69%、95.41%、94.50%、89.19%、92.67%和95.63%.采用PCR-DGGE指纹分析技术初步研究了加入不同藻类水样的微生物群落结构,结果表明加入藻类的水样与原始水样的群落结构存在较大差异,但加入不同藻类的水样之间的相似度较高.溶藻系统中的微生物种类包括未培养的细菌类、Bacillus sp.、Bacillus cere-us、Stenotrophomonas sp.等.     

实时荧光定量RT-PCR检测剑尾鱼IgM mRNA方法的建立

根据剑尾鱼Xiphophorus helleri IgM和β-actin基因序列,分别在保守区域设计并合成引物,从注射免疫后的剑尾鱼头肾中提取总RNA逆转录合成cDNA,对目的片段进行PCR扩增、电泳纯化、T-A克隆及测序鉴定。将所得标准品质粒以10倍梯度进行稀释,采用SYBR Green I染料进行荧光定量扩增,构建标准曲线并进行融解曲线分析。结果表明:构建的剑尾鱼IgM和β-actin基因的标准品Ct值检测范围分别为7²1和821和8²5,扩增效率分别为2.025、1.970;融解曲线分析结果显示具有特异的单个峰,其Tm值分别为82.43℃、86.09℃,表明扩增产物特异性非常好。本实验中建立的剑尾鱼IgM基因实时荧光定量PCR方法可用于对剑尾鱼IgM基因的转录水平进行测定。     

牦牛雌激素受体ERα和ERβ基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异.根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布.结果表明,分别获得2 100 bp ERα(Gen Ban K登录号:KJ011123)和1 791 bp ERβ(Gen Ban K登录号:KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸.多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5%和53.9%-99.1%.荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ.此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低.而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之,心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低.为进一步了解牦牛ERα和ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础.     

牦牛和犏牛睾丸SAMD12基因的克隆测序及其mRNA水平比较

SAMD12是新近发现的SAM结构域家族成员.为进一步探究犏牛雄性不育的分子机制,实验从健康成年牦牛(n=10)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸组织中提取总RNA,利用常规基因克隆技术,对牦牛SAMD12基因进行克隆测序,并采用实时荧光定量PCR技术,比较牦牛和犏牛睾丸中SAMD12基因mRNA水平.结果本实验克隆获得了牦牛SAMD12基因的3种变异体,分别命名为v715、v779和v852.v715与普通牛5号变异体完全对应;v779含SAM结构域但与普通牛序列存在一些差异,可能是SAMD12基因的新变异体类型;v852无结构域部分可能不表现活性.定量PCR结果显示:SAMD12基因在牦牛和犏牛睾丸中均有表达,但表达量差异不显著,推测其表达水平与犏牛雄性不育无直接关系.     

环境水体中肠道病毒浓缩方法的比较

向水样中接种已知量的脊髓灰质炎病毒，然后利用微孔滤膜吸附-洗脱法、滑石粉-硅藻土吸附层吸附-洗脱法、化学絮凝沉淀法和滑石粉-硅藻土絮凝沉淀法等4种不同的浓缩方法对水样中的病毒进行浓缩，并采用实时定量RT—PCR技术对各方法浓缩后样品中的病毒进行扩增和检测。综合考虑病毒回收率和浓缩方法的可靠性与简便性等因素，确定微孔滤膜吸附-洗脱法为最优的浓缩方案。此外，还比较了三种洗脱液和两种二次浓缩方法的效果，并对各步骤的回收率进行了分析。     

基于便携式荧光定量PCR仪的兔病毒性出血症病毒现场检测方法的建立及应用

为建立兔病毒性出血症病毒免疫荧光PCR检测方法,参照GenBank中兔病毒性出血症病毒基因组序列,设计特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了能检测兔病毒性出血症病毒的荧光PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测兔病毒性出血症病毒灵敏度可达1.38LD_(50)·100μL~(-1),该法对兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌、兔沙门氏菌、兔水疱性口炎病毒(RVSTV)和兔轮状病毒(RRV)的检测结果均为阴性。试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法可对兔病毒性出血症进行现场快速鉴别诊断,为兔病毒性出血症的诊断及防控工作奠定了基础。     

川西北牦牛产志贺毒素大肠杆菌的流行病学调查

目的:旨在了解我国川西北草原牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的血清型和重要毒力基因的分布.方法:采用玻片凝集法和PCR方法分别检测STEC的血清型和15种重要的毒力基因.结果:在277份样品中分离鉴定出STEC 85株,分离率为30.69%,存在39个不同的O血清型,无优势血清型;牦牛源STEC毒力基因stx1、stx2、cnf1、cnf2、subA、CDT-V的携带率分别为44.71%、76.47%、2.35%、2.35%、61.16%、17.65%,黏附基因eaeA、iha、saa、efa1的携带率分别为1.18%、76.47%、68.24%、2.35%,以及60-MDa毒性质粒上的基因hlyA、espP、Katp的携带率分别为75.29%、43.53%、4.71%,不携带etpD、toxB基因.结论:STEC在我国川西北牦牛中的携带率高,血清型分布广泛,黏附基因iha和saa广泛分布于各种不同血清型的STEC中,大部分STEC携带毒性质粒,公共卫生学意义值得关注.