鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立鸡主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)BF1和BF2基因实时荧光定量PCR[Real-time fluorescent quantitative(FQ)-PCR]检测方法。方法从鸡外周血淋巴白细胞(Peripheral blood leuk-ocytes,PBLs)中提取细胞总RNA,以其为模板,根据BF1、BF2和GAPDH基因相对保守序列各设计一对引物,应用RT-PCR法扩增目的基因,分别克隆至pGM-T载体上,制备重组质粒标准品,经PCR、EcoRⅠ酶切及测序鉴定;优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立Real-time FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。结果重组质粒标准品经PCR、酶切及测序鉴定构建正确;建立的定量标准曲线临界循环数(Threshold cycle,Ct)与BF1、BF2和GAPDH起始质粒DNA拷贝数的对数之间线性关系良好,相关系数分别为1.00、0.98、0.99,扩增效率分别为0.8、1.1、1.1;该方法的敏感性可达101copies/μl;融解曲线分析表明扩增效率一致,特异性较好;质粒DNA标准品3次检测的CV值误差不超过0.5,均小于5%。结论已成功建立了鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法,为下一步应用该法检测BF1和BF2基因的转录水平奠定了基础。     

长效重组人生长激素纯化液中CHO-K1细胞残留DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以其为标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法;并对方法进行灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性及耐用性验证。结果建立的方法灵敏度可达2. 6×10~1 copies/μL。标准曲线的回归方程为y=-3. 487 x+30. 201,R~2=0. 999;检测样品中DNA回收率在73. 56%～101. 87%范围内,RSD均小于10%;该方法可特异性扩增CHO-K1细胞的基因组DNA,而Vero细胞、MDCK细胞、Wish细胞及大肠埃希菌等基因组DNA均未见明显的扩增;样品精密度测定Ct的RSD在0. 4%～2. 95%之间;于两种不同PCR仪器上检测标准品,扩增效率分别为98%、99%,相关系数R~2均为0. 999。结论成功建立了一种检测CHO-K1细胞表达Fc-rhGH纯化液的残留DNA的实时荧光定量PCR方法,该方法具有较好的灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性和耐用性。     

登革病毒Ⅰ型拷贝数标准质粒和检测体系的建立及其应用

目的建立登革病毒Ⅰ型(dengue virus-Ⅰ,DENV-Ⅰ)拷贝数标准质粒及其检测体系。方法将DENV-Ⅰ的前膜蛋白基因克隆至pMD19-T载体,建立DENV-Ⅰ标准质粒,采用实时荧光定量PCR法进行扩增,获得Ct值与病毒拷贝数的关系,绘制标准曲线,得到相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及检测体系对3份2017年云南西双版纳DENV-Ⅰ患者的血清进行检测。结果经双酶切及测序鉴定,DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒构建正确。实时荧光定量PCR得到的标准曲线方程为y=-0. 300 5 x+12. 133,R~2=0. 991 9。3份血清样品原液的病毒拷贝数分别为9 417 703. 12、21 949 591. 01及19 027 096. 91 copies/μL。结论成功建立了DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒及其检测体系,且准确性较好,灵敏度较高,可用于血清样品中DENV-Ⅰ拷贝数的检测。     

H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并检测H5N1 AIV感染前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。方法提取豚鼠肺脏组织RNA,反转录合成cDNA,将cDNA模板按10倍系列稀释为9个浓度(1.00 E+10~1.00 E+02 copies/μl),进行PCR扩增。以β-actin为内参,建立标准曲线,比较两基因的扩增效率,验证该方法的引物特异性、重复性及灵敏度。同时用该方法检测H5N1 AIV攻毒前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。结果 c DNA模板最佳稀释度范围为1.00 E+09~1.00 E+04。豚鼠MAVS和β-actin基因的标准曲线斜率差值0.1,R~2=0.999,扩增效率分别为100.2%和100.3%;两基因扩增溶解曲线峰单一,可扩增出清晰的目的条带,且无非特异性扩增;两基因Ct值的变异系数(CV)均10%;灵敏度为1.00 E+03 copies/μl。感染H5N1 AIV的豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平下调。结论成功建立了H5N1 AIV感染豚鼠体内MAVS的SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并发现H5N1 AIV感染可导致豚鼠体内MAVS表达水平下调。     

荧光定量PCR方法在脊髓灰质炎病毒突变分析中的应用

目的建立检测脊髓灰质炎病毒突变比例的荧光定量PCR方法,并进行验证及初步应用。方法分别建立检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒突变株和非突变株的荧光定量PCR方法,并进行特异性、重复性和灵敏度验证。通过Ct值计算样品的突变比例(revertant proportion,RP),并进行准确性和重复性验证。采用建立的荧光定量PCR方法检测脊髓灰质炎病毒减毒株的突变比例。结果建立的检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒突变株和非突变株的荧光定量PCR方法能够特异性扩增相应基因片段;重复性试验Ct值的变异系数(CV)为0.085%~5.564%;灵敏度为1×10-7~1×10-6ng,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型非突变荧光定量PCR可分别检测到含量约0.084 3、0.029 2和0.266 7 CCID50的病毒。荧光定量PCR测定RP的方法经验证发现,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合质粒对照的RP检测值与理论值的差异较小,分别为0.040 9±0.037 4、0.008 8±0.034 3和-0.029 6±0.026 8。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎减毒株的RP分别为0.001 0、0.002 0和0.001 7。结论荧光定量PCR分析脊髓灰质炎病毒突变比例的方法,特异性、重复性及准确性均较好,并具有较高的灵敏度,可用于实验室内部对脊髓灰质炎病毒的突变比例测定,并可能成为脊髓灰质炎病毒体内或体外神经毒力评价的替代方法。     

牛副流感病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的Taq Man荧光定量PCR方法。方法根据GenBank中公布的BPIV3序列,选取P基因上保守区域设计特异性引物及TaqMan-MGB探针。优化反应体系,建立实时荧光定量PCR方法,并对方法的特异性、重复性和敏感性进行验证。结果标准曲线在104~108copies/μl范围内具有良好的线性关系,R~2达到0.999,斜率为-3.203,扩增效率为105.2%。利用该方法对BPIV3a及BPIV3c进行检测,结果为阳性,对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectioils bovine rhinotraeheitis virus,IBRV)进行检测,结果呈阴性。3个浓度质粒标准品,重复3次检测,CV均小于1.5%。建立的方法对质粒的最小检出量为1.0×10~2 copies/μl。结论建立了能够检测BPIV3a及BPIV3c的TaqMan-MGB探针实时定量PCR方法,该方法特异性较强,重复性及敏感性良好,为早期诊断及定量分析提供了更快速、稳定、可靠的方法。     

鼠源性病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的 建立8种鼠源性病毒的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,Q-PCR)检测方法，并进行验证。方法 通过4个实验室验证Q-PCR法的特异性、灵敏度及精密性，同时进行病毒模拟污染试验及盲样检测，并将检测结果进行比对。采用Q-PCR法检测26批SARS-CoV-2疫苗生产用单抗细胞株及15批其他鼠源性制品。结果 用于8种鼠源病毒检测的Q-PCR法与同科同属或其他鼠源病毒无交叉反应；除实验室2对鼠痘病毒(又名脱脚病病毒)(ectromelia virus,EctV/Mouse Pox,MPV)检测的灵敏度为2×10²copies/μL外，实验室2对其他7种病毒及其他3个实验室对8种鼠源性病毒的检测灵敏度均为2×10¹copies/μL；除实验室3对鼠腺病毒(mouse adenovirus,MAdV)检测拷贝数试验间CV为37.58%外，实验室3对其他7种病毒和其他3个实验室对8种病毒检测的试验内、试验间Ct和拷贝数CV均<25%。病毒模拟污染试验检测灵敏度均符合参数要求；4个实...     

TaqMan MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA方法的适用性验证及应用

目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高(10-2 ng/μl)、中(10-4 ng/μl)、低(10-6 ng/μl)浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数(CV)为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。     

细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,MMLV)逆转录酶活性参考品绘制标准曲线,进行逆转录酶活性的定量。对反应的引物和2×RT-PCR Mix进行优化,并对建立的方法进行线性关系、灵敏度、精密度和准确度验证。结果 1组引物(上游:5′-CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG-3′,下游:5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3′)更适合本方法;Promega公司生产的2×RT-PCR Mix具有更高的反应效率。逆转录酶活性在5.40×108~5.40×104pU/μl范围内定量标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999 7;该方法判断样品阴阳性的标准cut-off值为1.31×104 pU/μl;检测CHO-1细胞株样品逆转录酶活性的试验内变异系数(CV)为0.80%,试验间CV值为16.4%;检测5株细胞样品逆转录酶活性的平均加标回收率为122.8%。结论建立了生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,该方法能够准确地定量检测细胞株的逆转录酶活性。     

实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

目的建立实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。方法采用双标准曲线法,分别利用含有GAP基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线。将含有外源GFP基因的毕赤酵母基因组进行实时荧光定量PCR,通过标准曲线计算出外源GFP基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数。结果毕赤酵母GAP基因Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:y=-3.612x+39.28,GFP基因Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:y=-3.544x+37.99,GAP基因和GFP基因的反应效率分别为0.89和0.90,两条标准曲线的相关系数均为0.999,且均有良好的重复性。检测10个转入GFP基因的毕赤酵母菌株,筛选到9个单拷贝整合GFP基因的菌株和1个多拷贝整合GFP基因的菌株。结论已建立了检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR法,该方法能够筛选出不同外源基因拷贝数的毕赤酵母菌株。     

人巨细胞病毒融合表达载体的构建及鉴定

目的构建含人巨细胞病毒(HCMV)gB680糖蛋白基因和突变的pp65蛋白基因(pp65m)的融合表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达。方法用PCR法从HCMV基因组中钓取gB680和pp65m蛋白基因,分别亚克隆入pMD18-T载体中,经酶切鉴定并测序后,构建真核表达载体pVAX1/gB680+pp65m,以ELISA法检测其在COS-7细胞中的瞬时表达。结果重组质粒含有gB680和pp65m融合基因,并能在COS-7细胞中表达。结论已成功构建了人巨细胞病毒融合表达载体,并可在真核细胞中表达。     

TaqMan实时定量RT-PCR检测轮状病毒G4型

目的应用基于TaqMan探针的实时定量RT-PCR检测轮状病毒(Rotavirus,RV)G4型VP7基因。方法从G1、G2、G3和G4型轮状病毒Vero细胞培养物中提取病毒总RNA,分别进行RT-PCR和实时定量RT-PCR,检测引物及探针的特异性;构建含轮状病毒G4型VP7基因的质粒,制备RNA参考品,绘制实时定量RT-PCR标准曲线;验证实时定量RT-PCR的灵敏度和精密性;对5个轮状病毒G4型培养物及G1、G2和G3型各3个病毒培养物进行检测,分析其实际应用性。结果以轮状病毒G4型VP7基因引物和探针只能从G4型轮状病毒总RNA中扩增出目的基因或检测到荧光信号的扩增,未在G1、G2、G3型轮状病毒总RNA中扩增出目的基因或检测到荧光信号的扩增;在2.34×107～2.34×103拷贝/μl范围内,反应扩增效率大于90%,R2大于0.98;该方法可检出100数量级的RNA样品,且试验内及试验间变异系数分别小于2.5%和4%;用建立的实时定量RT-PCR只检出5个轮状病毒G4型样品,而G1、G2、G3型样品均未检出。结论 TaqMan实时定量RT-PCR是一种灵敏度较高、特异性和精密性良好的定量检测轮状病毒G4型的方法。     

重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用

目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、最低检测限及试验可行性和干扰性进行验证;将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性。结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法最佳线性范围为1×108～1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5%,试验内病毒定量拷贝数的CV在20%～30%之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20%～50%之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,最低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50。该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性。NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性。结论成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础。     

嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC的重组腺病毒,并检测其表达。方法采用PCR和重叠PCR法构建真核表达质粒Migr1-TrCP-CC-HA和Migr1-△F-CC-HA,以此为模板,通过PCR将其克隆至穿梭质粒pAd-Track-CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-TrCP-CC和pAdTrack-△F-CC,再与骨架载体pAdeasy-1经同源重组得到重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC,转染HEK293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,测定其滴度,并经RT-PCR检测目的基因的转录水平。结果经酶切和测序证实重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC构建正确,经HEK293细胞包装后显微镜下可观察到绿色荧光,病毒滴度分别为2.5×109和1.0×109pfu/L,经RT-PCR检测目的基因可有效表达。结论已成功构建重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究其靶向融合蛋白Bcr-Abl泛素化和降解的机制奠定了基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠpCMV启动子下游,构建pVAXⅠ-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测。结果Asia 1型FMDV真核表达载体pVAX1PⅠ-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达。结论pVAXⅠ-P1-2A-3C可作为Asia1型FMD核酸疫苗的候选疫苗。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株与临床分离株可变区基因的序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)Oka株(V-Oka株)与分离于临床水痘患者的野毒株进行可变区基因序列比对分析。方法提取V-Oka株和VZV临床分离株的基因组DNA,对其串联重复序列区(R区)进行PCR扩增和测序;将R3基因的纯化产物与pMD18-T载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,提取质粒,经双酶切鉴定及测序;将测序结果与GenBank中登录的V-Oka株基因序列进行比对分析。结果 R1～R5基因扩增产物及R3基因重组质粒的双酶切产物片段大小均与预期相符;V-Oka株较稳定,测序结果与GenBank中登录的V-Oka株R1～R5基因序列一致,野毒株R区序列呈现多态性,与V-Oka株有差异,R4区序列区别明显。结论水痘患者的致病毒株为野毒株;R4的重复单位拷贝数可为临床快速鉴别V-Oka株与野毒株提供科学的手段。     

NA-1株鹅源副粘病毒M、F和HN蛋白基因的真核表达

目的获得鹅源副粘病毒(GPMV)NA-1株M、F和HN基因真核表达蛋白。方法将NA-1株GPMV经SPF鸡胚增殖、纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank登录的NA-1株GPMV基因组序列,设计3对特异性引物,利用RT-PCR法,分别扩增M、F和HN基因开放阅读框(ORF),将目的基因克隆至pMD18-T-Simple载体,并进行酶切和序列测定。将目的片段克隆至pCI-neo表达载体,酶切鉴定正确的重组质粒,分别命名为pCI-M、pCI-F和pCI-HN。将重组表达质粒分别转染Vero细胞,用间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达。结果RT-PCR法分别扩增出M、F和HN基因,大小与预期一致。克隆载体及表达载体酶切及测序鉴定正确;重组真核表达质粒转染Vero细胞后,荧光显微镜下可见特异性荧光。结论利用pCI-neo真核表达载体在Vero细胞中成功表达了NA-1株GPMV M、F和HN基因,为下一步研究该病毒的出芽机制以及各结构蛋白的功能奠定了基础。