新型生物防腐剂——多聚阳离子抗菌肽在毕赤酵母中的表达

在毕赤酵母GS115中表达一种新型食品生物防腐剂——多聚阳离子抗菌肽(poly-cationic antibacterialpeptide,PCAP)。根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成编码多聚阳离子抗菌肽与多聚阴离子肽融合肽的DNA序列,连接并克隆入酵母表达载体pPIC9,得到重组表达质粒pPIC9-PCAP,并转化至毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆子,用体积分数0.5%的甲醇诱导表达,优化表达条件,表达产物用Tricine-SDS-PAGE分析,在分子质量8kD左右处可见目的蛋白表达条带,表明融合肽成功地在毕赤酵母中分泌表达。在pH2.0条件下将表达产物采用胃蛋白酶酶解,分离得到的碱性多聚阳离子肽对食品腐败微生物枯草芽孢杆菌具有明显的抑菌作用。     

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。     

康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在毕赤酵母中的表达研究

在毕赤酵母中表达康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶基因cbhI。提取经诱导的康氏木霉mRNA,通过反转录及PCR反应扩增纤维素酶cbhI基因cDNA。将cbhI基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,采用电激法将经SacⅠ线性化的重组质粒pPICZαA-cbhI转化毕赤酵母GS115,MD及G418抗性平板筛选cbhI基因高拷贝转化子,并用PCR鉴定转化子。BMMY培养基中加入0.5%甲醇对毕赤酵母进行纤维素酶CBHI诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,表达的重组蛋白相对分子质量约67 kD,pNPC酶活为24.1 U/L,酶蛋白量为0.22 mg/mL,表明,康氏木霉cbhI可以在毕赤酵母中表达,并具有较高活性。     

人α-防御素5前体蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究

为了探索人α-防御素5(HD5)前体蛋白基因在酵母中高效分泌表达的可行性,将其对应基因克隆到载体pPIC9K,得到重组载体pPIC9K-preproHD5,经SacI线性化后,转入Pichiapastoris GS115,得到重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-preproHD5。应用PCR技术筛选高拷贝转化株,用BMGY培养GS115/pPIC9K-HD5至OD600为2～6时,用BMMY诱导培养120h,离心取上清液,用Tricien-SDS-PAGE和蛋白定量试剂盒分析人α-防御素5前体蛋白的表达量。琼脂扩散法检测人α-防御素5前体蛋白的抑菌活性,发现其对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(ATCC10231)2种标准菌株具明显的抑菌活性。人α-防御素5前体基因可在毕赤酵母实现分泌型表达,该策略可能成为防御素工业化开发的有效途径。     

解淀粉芽杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达.SDS-PAGE试验表明,该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达.植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L.     

Lactobacillus kefiranofaciens 乳糖酶基因克隆及在毕赤酵母中表达

以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组为模板,PCR扩增得到乳糖酶中LacL、LacM两个大小亚基片段,经EcoRI和SnaBI双酶切后,分别连接pPIC9K质粒,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并验证其核苷酸序列正确。将重组质粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分别电转化毕赤酵母GS115,构建pPIC9K-LacL-GS115重组子和pPIC9K-LacM-GS115重组子,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/mL,具有多拷贝基因的重组子。经反转录PCR验证,cDNA上存在LacL片段,并可检测到乳糖酶酶活达到1.17 U/mL;pPIC9K-LacM-GS115重组子诱导表达72 h后的发酵液上清经SDS蛋白电泳检测到目的条带。     

抗菌肽Taponicin Ⅱ基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin Ⅱ基因.按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin Ⅱ基因的重组质粒pPICZαA-Jap,结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表达载体pPICZαA-Jap.     

抗菌肽Japonicin II基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin II基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin II基因的重组质粒pPICZαA-Jap,结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinII基因真核表达载体pPICZαA-Jap。     

抗菌肽Japonicin Ⅱ基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin Ⅱ基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上，经PCR鉴定及序列分析，所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin Ⅱ基因的重组质粒pPICZαA-Jap，结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表达载体pPICZαA-Jap。     

枯草芽孢杆菌B2（Bacillus subtiIis B2）木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛。将编码枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115／pPIC9K-XYN。初步研究表明：以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程茵摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可达1542.6U／mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性。     

枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

cp4-epsps基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为建立一种新的外源蛋白安全评估方法,构建转外源基因酵母是关键步骤。本研究以来源于转基因作物的抗除草剂合成酶蛋白CP4-EPSPS为研究模板,首先通过基因优化和化学合成获得cp4-epsps基因,优化后基因密码子适用性指数(CAI)为0.85,GC含量为52%。目的基因克隆至毕赤酵母表达载体p PICZb,经鉴定筛选正确的重组载体p PICZb-EPSPS电击转化至毕赤酵母GS115,cp4-epsps基因通过同源重组方式整合至酵母基因组,PCR扩增酵母基因组筛选得到在正确位点发生同源重组的4株阳性菌株。随后,各阳性菌株分别于28℃、250~300 r/min培养,0.5%甲醇诱导4 d后,提取各组菌株总蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鉴定CP4-EPSPS表达的正确性。CP4-EPSPS单克隆抗体及载体标签C-MYC单克隆抗体的western blotting结果一致显示cp4-epsps基因在毕赤酵母GS115中成功获得表达,大小约50 ku。本实验成功构建了转cp4-epsps基因的毕赤酵母基因工程菌,为下一步开展转基因作物CP4-EPSPS成份的安全评价奠定基础。     

Monellin-EGFP 融合蛋白在毕赤酵母中的表达

根据已报道的Monellin甜蛋白氨基酸序列,结合毕赤酵母与桑树密码子的偏好性,人工设计合成单链monellin基因,并与增强型绿色荧光蛋白EGFP基因连接,构建融合表达载体。采用电击转化法成功将表达载体导入毕赤酵母GS115中,并获得高效表达的重组子pPIC9K-M-E。经PCR检测,SDS-PAGE和Western Blot杂交证实已表达出融合蛋白,该蛋白经纯化与盲测实验,结果显示其甜度约为标准蔗糖的500倍。     

木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较

根据木聚糖酶Xyn43A基因序列,设计特异性引物,以p MD18-T-Xyn43A重组质粒为模板克隆Xyn43A成熟肽基因,将该基因分别克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,分别在大肠杆菌BL21及毕赤酵母GS115中表达。重组酶在大肠杆菌中胞内表达,比酶活力可达61.43 U/mg。重组酶在毕赤酵母中分泌表达,比酶活力可达145.24 U/mg。酶学性质显示,BL21-Xyn43A、GS115-Xyn43A重组酶最适温度、p H相同均为45℃、p H 5.0。GS115-Xyn43A温度稳定性、p H稳定性均优于BL21-Xyn43A。     

嗜热芽孢杆菌CHB1环糊精酶基因优化及其在毕赤酵母中的表达

为实现新型CGTase在毕赤酵母中的高效表达,提取嗜热芽孢杆菌CHB1基因组DNA为模块,PCR扩增野生型基因CGT1,编码680个氨基酸。将该基因进行密码子优化CGT2,与野生型基因CGT1分别插入分泌型载体pPICZαA转化毕赤酵母GS115,获得两株酵母工程菌GS115/pPICZαA-CGT1和GS115/pPICZαA-CGT2;经甲醇诱导表达120 h后,CGT2活力达0.62U/mL,是优化前CGT1(0.37 U/mL)活性的1.7倍;进一步对GS115/pPICZαA-CGT2进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH 6.5、28℃、200 r/min、每24小时补加体积分数1.5%的甲醇诱导,120 h后其胞外酶活力达到1.26 U/mL,是优化前的两倍。     

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

本研究采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度Monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度Monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实Monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Western blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白存在正常活性.     

烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

为了筛选高效表达壳聚糖酶的毕赤酵母菌株。重组质粒pPIC9K-CSN经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子,PCR鉴定后,用G418梯度浓度筛选多克隆子,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。经PCR分析,质粒转到宿主菌GS115,在G418为4mg/mL时,筛选到了多克隆子,经SDS-PAGE分析表明分泌表达蛋白的相对分子量约为25kDa,酶活为14.59 U/mL。     

毕赤酵母工程菌表达猪β-干扰素

根据毕赤酵母密码子偏爱,人工合成了猪β-干扰素(PoIFN-β)基因,构建了重组载体pPICZA-PoIFN-β。重组载体经Sac I线性化后,电击转入毕赤酵母GS115,对在含博莱霉素(Zeocin)平板上生长的转化子进行鉴定,得到分泌表达猪β-干扰素的毕赤酵母基因工程菌株GS115/pPICZA-PoIFN-β。以1%甲醇诱导GS115/pPICZA-PoIFN-β表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,工程菌株实现了猪β-干扰素的高效分泌表达,表达产物为相对分子质量22ku和26ku的混合物,表达蛋白量约为80mg/L。     

杂合抗菌肽Me-HNP1真核表达载体的构建与初步表达

选择蜂毒肽(Melittin)和人体防御素(HNP-1)部分基因序列进行人工融合,通过生物信息学技术预测其理化性质和功能结构,依据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏爱性原则编码杂合肽Me-HNP1基因,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增目的基因并定向克隆至穿梭型表达载体pPICZa A上,将构建成功的分泌表达载体pPICZαA-Me-HNP1通过电转化的方式转化到毕赤酵母感受态细胞GS115内,以甲醇为诱导剂进行诱导表达,将得到的粗蛋白进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳在5 kDa处得到一条单一清晰条带,表明杂合抗菌肽Me-HNP1在毕赤酵母中成功表达,生物信息学分析得出杂合抗菌肽Me-HNP1分子内带有8个正电荷,等电点为9.55,脂溶性80.44,在酵母体内半衰期大于20 h。表明其具有成为优秀抗菌肽潜力。为抗菌肽的研究奠定了实验基础。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达

从高产糖化酶的黑曲霉的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在毕赤酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,电转化毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72 h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6 U/mL。测定结果显示,其糖化酶大小为1 908 bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子质量大约为80 ku。黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母GS115中成功得到了表达。